[发明专利]一种检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光定量PCR基因分型方法及其试剂盒，特别是一种检测 原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法及其试剂盒。

背景技术

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内高发病率的恶 性肿瘤之一，在常见肿瘤中其发病率居第五位；HCC的年死亡数与同年新发病 数大致相仿，在肿瘤相关的死亡率中占第三位，仅仅低于肺癌和胃癌。中国也 是肝癌高发国家，HCC占我国原发性肝癌的90％，HCC是我国最常见的恶性肿 瘤之一，严重威胁人民群众的身体健康，因此也是我国重点研究的课题之一。

目前所知，肝癌形成是一个多基因和多步骤的过程，涉及到染色体1p，4q， 8p，8q，10q，11p，13q，16p，17p，19p和22q等染色体畸变(chromosomal aberrations)，导致控制细胞生长或抑制的一些基因功能发生改变。

葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)，又名70千道尔顿热 休克蛋白5(heat shock 70kDa protein 5，HSPA5)，与热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)家族具有同源性，被认为是HSP70家族的成员之一。人类的 GRP78基因定位于染色体9q33上。GRP78基因含有8个外显子7个内含子。在 内质网中发现了GRP78的基因产物，在内质网内，它与免疫球蛋白 (immunoglobulin，Ig)重链牢固结合，阻止未成熟重链的自身结合，直至重链和轻 链结合。这证明GRP78蛋白是一个内质网驻留蛋白。

作为一种应激(stress)相关的重要分子伴侣(chaperone)，GRP78涉及到 多种肿瘤(包括HCC)的演化。HCC组织中GRP78蛋白的表达升高，常常预 示着预后的不良。但目前GRP78基因的多态性与HCC的风险和预后的关系， 在基因水平寻找HCC的基因诊断标记物和预后因子等相关的研究比较少，特别 是目前还没有预测中国人原发性肝细胞癌易感性试剂盒及检测方法。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定 量PCR基因分型方法。

该检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法包括如下 步骤：

(1)针对GRP78基因第5个内含子rs430397位点的多态性，设计PCR反 应引物和荧光探针；

(2)在反应体系中加入所述步骤(1)中的PCR反应引物、荧光探针和PCR 反应液；

(3)将所述的步骤(2)得到的混合溶液置于荧光定量PCR仪上反应。

通过NCBI数据库和dbSNP数据库获得GRP78基因参考序列及rs430397位 点，设计该SNP的扩增引物和荧光探针。GRP78基因部分参考序列如下：

GTATGTTCCT TGTTTTCTGC TTTGCTAATG AGATCTCCTT AGACTCTGAA

TTCAGGACAT    TGCATCTAGA     TACTTAGATA     ACAGACATCA

CAGTAACCAT    TCTTTTTTC    TAGGATCTGT    TCCGGTCTAC

TATGAAGCCC    GTCCAGAAAG     TGTTGGAAGA     TTCTGATTTG

AAGAAGTCTG ATATTGA

上面方框标出的位点即为多态位点。

所述的PCR反应引物的序列如下：

正向引物：5’-CCT TGT TTT CTG CTT TGC TAA TGA-3’；

反向引物：5’-CAT AGT AGA CCG GAA CAG ATC CTA GA-3’。

所述的荧光探针的序列如下：

5’-FAM-CAT CACAGTAAC CATATC-3’和

5’-VIC-CATCAC AGT AAC CAT GTC-3’。

探针的5’末端标记荧光探针，一个等位基因标记VIC，另一个等位基因标 记6-carboxyfluorescein(FAM)。

所述的PCR反应引物的终浓度为500nM。