[发明专利]用于多项肿瘤骨转移标志物并行检测的液相芯片及其制备方法

权利要求书

1、一种多项肿瘤骨转移血清标志物并行检测液相芯片，其特征是，主要包括有：

(1)包被微球：含有分别包被了ET-1的捕获抗体的微球、包被了SDF-1/CXCL12捕获抗体的微球、包被了PDGF-BB捕获抗体的微球、包被了PDGF-AA捕获抗体的微球，包被了FGF捕获抗体的微球、包被了IGFBP-3捕获抗体的微球、包被了IGF-I捕获抗体的微球、包被TGF-β1捕获抗体的微球、包被了BMP-2捕获抗体的微球、包被了BMP-7/OP-1捕获抗体的微球、包被了BMP-6捕获抗体的微球、包被了activin A捕获抗体的微球、包被了IL-11捕获抗体的微球、包被了OCIF/OPG捕获抗体的微球、包被了RANKL捕获抗体的微球、包被了PTHrP捕获抗体的微球、包被了BALP捕获抗体的微球、包被了BSP捕获抗体的微球、包被了OC捕获抗体的微球、包被了IL-8捕获抗体的微球、包被了IL-6捕获抗体的微球、包被了IL-1a捕获抗体的微球、包被了IL-1β捕获抗体的微球、包被了TNF-a捕获抗体的微球、包被了OPN捕获抗体的微球、和包被了VEGF捕获抗体的微球中的3种以上，上述微球分别具有不同颜色编码；

(2)生物素标记的检测抗体：含有分别用生物素标记的ET-1、SDF-1/CXCL12、PDGF-BB、PDGF-AA、FGF、IGFBP-3、IGF-I、TGF-β1、BMP-2、BMP-7/OP-1、BMP-6、activin A、IL-11、OCIF/OPG、RANKL、PTHrP、BALP、BSP、OC、IL-8、IL-6、IL-1a、IL-1β、TNF-a、OPN、VEGF的检测抗体中的3种以上，该3种以上的检测抗体与(1)中的捕获抗体相对应；和3)链亲和素藻红蛋白。

2.根据权利要求1所述的多项肿瘤骨转移血清标志物并行检测液相芯片，其特征是，它由以下组成：(1)包被微球：含有分别包被了ET-1的捕获抗体的微球、包被了SDF-1/CXCL12捕获抗体的微球、包被了PDGF-BB捕获抗体的微球、包被了PDGF-AA捕获抗体的微球，包被了FGF捕获抗体的微球、包被了IGFBP-3捕获抗体的微球、包被了IGF-I捕获抗体的微球、包被TGF-β1捕获抗体的微球、包被了BMP-2捕获抗体的微球、包被了BMP-7/OP-1捕获抗体的微球、包被了BMP-6捕获抗体的微球、包被了activin A捕获抗体的微球、包被了IL-11捕获抗体的微球、包被了OCIF/OPG捕获抗体的微球、包被了RANKL捕获抗体的微球、包被了PTHrP捕获抗体的微球、包被了BALP捕获抗体的微球、包被了BSP捕获抗体的微球、包被了OC捕获抗体的微球、包被了IL-8捕获抗体的微球、包被了IL-6捕获抗体的微球、包被了IL-1a捕获抗体的微球、包被了IL-1β捕获抗体的微球、包被了TNF-a捕获抗体的微球、包被了OPN捕获抗体的微球、和包被了VEGF捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；(2)生物素标记检测抗体：分别用生物素标记的ET-1、SDF-1/CXCL12、PDGF-BB、PDGF-AA、FGF、IGFBP-3、IGF-I、TGF-β1、BMP-2、BMP-7/OP-1、BMP-6、activin A、IL-11、OCIF/OPG、RANKL、PTHrP、BALP、BSP、OC、IL-8、IL-6、IL-1a、IL-1β、TNF-a、OPN、和VEGF的检测抗体；

和(3)链亲和素藻红蛋白。

3.一种制备权利要求1所述的肿瘤骨转移标志物检测液相芯片的方法，其特征是，主要步骤包括：

(A)每种捕获抗体包被微球：-取2×10⁶～4×10⁶个微球活化；

-活化后的微球去除上清，加入300～400ul偶联缓冲液清洗一次；

-往微球中加入1.08～8.64μg权利要求1中所述捕获抗体中的一种，加偶联缓冲液将总体积补至400～450μL，涡旋混匀，室温涡旋孵育2hr；

-偶联抗体后的微球去除上清，加入400ul分析缓冲液，室温涡旋孵育25～30min；

-去除上清液，加入400～800ul的分析缓冲液清洗两次；

-包被好的微球加入约100～200ul分析缓冲液；

按上述方法分别得到所选的捕获抗体包被的微球，所述微球分别具有不同颜色编码；

(B)生物素标记检测每种抗体：

-分别用pH7.4的PBS稀释每种检测抗体至1mg/ml～2mg/ml，为检测抗体溶液；

-按摩尔比1∶80～1∶120加入一种与(A)中所述捕获抗体对应的检测抗体溶液与10mg/mlNHS-Biotin反应液；

-加入NaHCO₃溶液使反应体系pH值为8～9；

-室温涡旋孵育2hr～4hr；

-脱盐；分别得到与(A)中所述捕获抗体包被微球相对应的生物素标记后的检测抗体。