[发明专利]一种用于防治肝硬化的人源细胞珠蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种用于防治肝硬化真核蛋白质的重组表达。

背景技术

我国是肝病大国，据2002年国家卫生部肝病研究组的统计资料显示，全国乙型肝炎感染就诊人数为7500万人次，居全国各类传染病之首。与此同时，脂肪肝、酒精肝、药肝和肝硬化等其他肝脏疾病的发病率同比上升了17.8％，达到5000万，已经成为威胁我国人民生命健康的又一严重社会问题。在慢性肝炎中25％左右经过5～10年将会转为肝硬化，肝硬化中约20％将转为原发性肝癌。另资料统计显示，60％的嗜酒者患有脂肪肝；30％的酒精性脂肪肝可演变为肝纤维化；10％以上可转化为肝硬化。

研究表明，肝纤维化是肝硬化的前期病理阶段，是肝脏受到慢性损伤时，细胞外基质(ECM)可逆性沉积的创伤愈合过程。积极探索肝纤维化发病机制，寻求有效治疗措施对降低肝硬化发病率和死亡率具有重要意义。阻止肝纤维化的进展或促进纤维化的逆转是治疗的关键。国内外目前治疗本病尚无可靠药物，西药抗肝纤维化治疗疗效差且副作用大；近年来国内外医药界开始重视中医药抗肝纤维化的研究。但在理法方药理论指导下药理实验证实疗效可靠的中成药尚属空缺。肝硬化患者用药总的原则是少用药、精选用药，切忌滥用、盲目用。因为服食的各种药物都必须经过肝脏解毒处理，滥用药物很可能不但起不到保护肝脏的作用，反而加重肝脏的负担，得不偿失。利用生物技术治疗该疾病的研究，是基于机体发病的机理而作出针对其关键过程的治疗，同时药物来源于机体的本身，具有高疗效、低副作用的特点，市场前景良好。

目前认为，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)在肝纤维化发生发展中起主导作用。在各种致病因素作用下，静止期HSC被激活并增殖、转化为肌成纤维样母细胞，合成和分泌ECM上调，同时合成和释放大量基质金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)，使间质胶原酶等蛋白酶活性降低，ECM降解减少，最终导致ECM积聚而发生肝纤维化乃至肝硬化。

国内外学者对肝纤维化的可逆性已无异议。鉴于HSC在肝纤维化发病机制中的主导作用，大多数抗肝纤维化研究都以HSC为靶标。通过对抗氧化应激，抑制炎症反应，调节相关细胞因子的活性，干扰细胞因子信号转导等途径抑制HSC增殖、活化，诱导HSC凋亡，均可呈现一定的抗肝纤维化效应。

Kawada等(见Biol Chem.2001，276(27)25318-25323)在进行大鼠肝星状细胞的蛋白质组学研究时，发现了一种新蛋白，该蛋白在肝星状细胞活化的过程中有明显的上调表达，揭示该蛋白在肝纤维化过程中发挥着重要的生物功能。目前在国际上比较多的被命名为细胞珠蛋白(cytoglobin，Cygb，GeneID：114757)，也有人称之为肝星状细胞激活相关蛋白(Stellatecell activation-assciated protein，STAP)，它属于一个新发现的hexacoordinate globin超家族的成员，该家族的成员在动物，蓝细菌及植物中都有表达。研究表明，该蛋白家族的一些成员，可以清除机体内的毒素，例如氧化亚氮(nitric oxide)，过氧化亚硝酸盐(peroxynitrite)，以及氢过氧化物(hydrogen peroxide)。Ruian Xu等人的研究也证实了在大鼠的肝星状细胞中过表达cytoglobin可以缓解氧化压力，抑制肌成纤维样母细胞的分化，同时减少细胞外基质的沉降。

细胞珠蛋白可以从动物和人的细胞组织中提取得到，但是可获得量极少，不能满足临床的需求，因此，学者们将研究方向转向了原核表达。众所周知，真核生物中的大部分功能蛋白在表达后需要经过一系列的修饰折叠形成高级结构才具有生物活性，将这类蛋白的基因转到原核生物中虽然也可获得一级结构相同的蛋白质，但是原核生物中缺少蛋白修饰折叠所需的工具，往往所得的蛋白质由于不具备正确折叠的高级结构而导致其生物活性较低甚至丧失生物活性。