[发明专利]军团菌快速检测与分型方法

说明书

技术领域：

本发明涉及军团菌检测和分型方法的技术领域，具体为一种不仅能检测军 团菌，而且可以将军团菌分型为嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的军团菌快速检测 与分型方法。

背景技术：

现代分子分型技术主要包括质粒DNA图谱分析、限制性内切酶消化后的 染色体DNA分析、核酸探针杂交、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、PCR以及多位点 序列分析(MLST)技术等。DNA重复序列PCR技术(Rep-PCR)的实用性强、低用 费、可再现性好，可用来进行普查工作。PFGE技术分辨力高，是病原微生物分 子分型的最佳选择。而有更高分辨力和再现力的MLST新技术正在逐渐被使用。 但是总体而言，PCR和限制性内切酶消化后的染色体DNA分析具有更加简便的 优点。

评估一项分子分型技术是否可行的标准有2个：完成标准(有效性)和便利标 准(效率性)。完成标准包括分型能力、分辨力和分型技术间的一致性；而便利标 准包括通用性、快捷性、解释和执行的容易程度。一项分型技术的分型能力意 味着通过这项分型技术，分离株被划分为所属类型的比例。分型技术间的一致 性，也就是再现性是指通过这种技术对同种样品在重复检测时，产生相同结果 的能力。分辨力是指拥有一致的或非常相似的相关图谱的分离株，事实上具有 相同的传播途径的可能性。因此，对一种分型技术来说首选标准是有效性。当 应用于军团菌时，一种分型技术必须要有效率性优点。操作和解释结果的容易 度以及所需费用、试剂和仪器的可行性都是选择一项分型技术的重要标准。

军团菌是一种胞内寄生的革兰阴性杆菌，在土壤和水系统中广泛存在。在 非典型肺炎的病例中，由军团菌引起感染的大约在5％～8％，病死率在5％～30％。 目前军团菌属有52种包括70多个血清型。嗜肺军团菌是军团菌属的一个种， 临床上80％以上的军团菌感染都是由该菌引起，其他菌种包括麦氏军团菌(L. micdadei)等均有致病性。因此，军团菌的早期检测对于军团菌感染的临床诊断 具有相当高的价值。目前对于军团菌感染的的实验室检验方法主要有血清抗体 检测、尿可溶性抗原检测、军团菌分离培养等。军团菌诊断以及对军团菌的流 行病学调查，最终依赖于被认为是确诊军团菌感染的“金标准”的直接分离培 养，即通过培养，找到病原菌。但是因为直接的分离培养，所需时间长，阳性 率低，培养基的配置复杂，价格昂贵等原因，这对军团菌的快速检测不利。所 以用分子生物学方法快速检测军团菌并对军团菌进行分型具有重要的现实意 义。

PCR方法具有很高的特异性与敏感性，它在检测军团菌中有着很广泛的应 用，可以通过PCR方法检测军团菌中的特异基因，达到快速检测军团菌的目的。 目前可以通过PCR扩增军团菌16S rRNA基因、5S rRNA基因、23S与5S之间 的间隔基因、巨噬细胞感染力增强因子(mip)基因检测军团菌。通过利用属特 异性引物扩增16S rRNA或5S rRNA基因片段，可特异的扩增军团均属16S rRNA 基因片段或5S rRNA基因片段。相对而言，16S rRNA基因片段，在军团菌属中 最为保守，所以具有更好的属特异性，已经有很多研究者的实验证明，利用一 对特异的引物扩增军团菌属16S rRNA基因386bp碱基片段可以将军团菌属与非 军团菌属区分。

而对军团菌属进行嗜肺与非嗜肺军团菌的分子分型方法目前主要依赖于设 计特定引物，用PCR方法扩增mip基因。mip基因的表达产物是巨噬细胞感染 力增强因子，它是一种分子量在24-27KD的外膜蛋白，在嗜肺军团菌的感染过 程中起重要作用它，可促进吞噬细胞对细菌的摄入，破坏细胞的杀菌功能。mip 基因大多存在于嗜肺军团菌中，但是一些非嗜肺军团菌，如阿尼沙军团菌 (Legionella anisa)，彼来特军团菌(Legionella beliardensis)，和一些非军团菌 属如链球菌(Streptococcus)，小梨球形菌属(Rhodopirellula)等也存在该基因。 所以通过PCR方法扩增mip基因对军团菌进行分子分型存在一定的不确定性， 即该方法的特异性不强。

发明内容：

本发明的目的是针对以上所述军团菌分子分型方法的繁杂，所需时间长以 及特异性不强等不足，提供一种能鉴别出军团菌，快速将其分子分型为嗜肺军 团菌与非嗜肺军团菌的快速、简便、特异性、敏感性较好的军团菌快速检测与 分型方法。