[发明专利]含过氧化氢酶基因的重组食品级乳酸菌无效
| 申请号： | 200910040974.1 | 申请日： | 2009-07-08 |
| 公开（公告）号： | CN101942408A | 公开（公告）日： | 2011-01-12 |
| 发明（设计）人： | 李充璧;李妍;李赛男;孙帆;梁盛年;李广宏;李芸瑛;黄丽华;陈庆华;赵建芬 | 申请（专利权）人： | 肇庆学院 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/74;C12R1/01 |
| 代理公司： | 广州三环专利代理有限公司 44202 | 代理人： | 刘宇峰 |
| 地址： | 526061 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 过氧化氢酶 基因 重组 食品级 乳酸菌 | ||
1.一种含过氧化氢酶基因的重组食品级乳酸菌，其特征在于：该乳酸菌是以乳酸乳球菌NZ9000为菌种，经基因工程重组构建的含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的过氧化氢酶基因的食品级重组乳酸菌。
2.如权利要求1所述的含过氧化氢酶基因的重组食品级乳酸菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①培养大肠杆菌，提取染色体DNA，采用限制性内切酶Sau3AI进行部分酶切，分离纯化2.5kb以上的DNA片段；
②大肠杆菌质粒pUC18/19经BamHI酶切后，与经Sau3AI进行部分酶切的不同片段用T4DNA连接酶连接，电击转化大肠杆菌，构建不同大小片段的大肠杆菌基因组文库；
③选择含有1％单宁酸及150ug/ml氨苄青霉素的脑心浸液作为培养介质，先于37℃厌氧培养2天，再于37℃有氧培养24小时，在培养平板上筛选出可导致单宁酸降解的克隆，即过氧化氢酶阳性细菌克隆；
④根据已报道的细菌过氧化氢酶基因的序列和保守区，设计以下三组引物：引物组一包含序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的引物；引物组二包含序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的引物；引物组三包含序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的引物；所述引物组二与引物组三均带有NotI/SphI酶切位点；
分别合成上述引物，对从阳性克隆中提取的质粒进行PCR检测；
⑤提取阳性克隆中的质粒，进行基因测序，测序结果为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
⑥经BamHI酶切，将阳性克隆的质粒的重组过氧化氢酶基因插入乳酸乳球菌载体pGK12或pRV300中，将该重组载体电击转化乳酸乳球菌NZ9000，用红霉素或氯霉素抗性筛选重组乳酸乳球菌，构建成含过氧化氢酶基因的食品级重组乳酸菌。
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