[发明专利]一种海马抗菌肽毕赤酵母工程菌及其在养殖中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说是一种抗菌肽基因转化毕赤酵母工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

海马(Hippocampus)是一种奇特的海洋生物，属脊椎动物亚门、鱼纲、海龙目、海龙科(Syngnathidae)。目前，全球已鉴定的的海马有35种。在我国，海马主要栖息在东南部海域，常见的共有5种(张朝晖等，1998年)，分别是线纹海马(H.kelloggi)、刺海马(H.histris)、大海马(H.kuda)、斑海马(H.trimaculatus)以及日本海马(H.japonicus)。

抗菌肽为动物体内免疫防御系统的重要组成部分，是一种氨基酸短链肽，被称为无污染的天然抗生素，具有广谱抗菌、无耐药性、热稳定、水溶性好、无毒无残留等优点，符合现代环保的观念。目前全球滥用抗生素的情况严重，有学者曾忧心地提出——由于人类在与细菌的“军备竞赛”中总是处于被动和落后的态势，当有朝一日人类研制的最强效的抗生素都因为超级细菌的存在而失效时，这个世界将会变成什么样子呢？据统计，目前我国尚有多达20种人畜共用或畜禽专用的抗生素作饲料添加剂，随着我国加入WTO，抗生素作饲料添加剂必将严重影响我们的家畜产品在国际市场的竞争力。将抗菌肽产品开发成新的代替传统抗生素添加剂的绿色饲料添加剂，将给我国的饲料添加剂行业注入一针强心剂，将整体提升饲料行业的层次，使我国的饲料产品在世界市场更具竞争力，推动我国饲料行业不断向前发展。

我们前期的实验结果表明从海马中克隆得到的两个抗菌肽基因hkplp和hkabf都具有很好的抗菌活性。以HKABF为例，重组HKABF对G⁺菌比较敏感，尤其是对金黄色葡萄球菌，在0.5ug/ml的蛋白浓度即可抑制稀释为约5×10⁶CFU/mL浓度的金黄色葡萄球菌。测试的微生物菌中，其次敏感的为白色葡萄球菌，MIC为2.5ug/mL，再次为华纳葡萄球菌(MIC为5ug/mL)和广州疾控中心分离出的金黄色葡萄球菌HI(MIC为5ug/mL)，中山大学附属二院分离鉴定出的金黄色葡萄球菌II(MIC为15ug/mL)，对于摩根氏菌(MIC为30ug/mL)和创伤弧菌(MIC为120ug/mL)这两种G^-菌在较低肽浓度下也能抑制其生长。对于其它G⁺和G^-菌甚至真菌(白色念珠菌、酵母、热带念珠菌)在比较高的蛋白浓度下有的也能显示出不同的抑菌效果。将两个抗菌肽基因hkplp和hkabf同时经毕赤酵母KM71重组表达，检测其抗菌活性表明HKPLP的抗菌活性要明显优于HKABF，因此我们选择了抗菌肽基因hkplp作为抗菌肽饲料添加剂的开发对象。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的抗菌肽HKPLP和编码该蛋白的基因hkplp。

本发明的另一个目的在于提供该抗菌肽制品的生产方法。

本发明的进一步目的在于提供该抗菌肽在饲料添加剂中的应用。

海洋抗菌肽对细菌、真菌有广谱抗菌能力，对病毒、原虫及癌细胞也有作用。一般来讲，海洋抗菌肽具有以下抗菌特性：(1)杀菌活力很高，致死浓度均在umol/L级；(2)作用迅速，往往在几秒或几分钟内可将99％以上的菌杀灭；(3)对真核生物细胞无毒性；(4)活性稳定，比较耐热，100℃下处理30min不丧失其抗菌活性；(5)在高盐环境下，许多海洋抗菌肽同样具有抗菌活性。

抗菌肽由于自身的优良特性显示出在食品储存、饲料安全和医药产业中广泛的应用前景。抗菌肽一般不含有稀有氨基酸和外源化学成分，是一种健康安全产品。在动物消化道中具有良好稳定性，同时具有免疫原性小、水溶性好、广谱杀菌甚至能够杀真菌、原虫且不产生耐药性菌株等优点，能耐受胃肠道中蛋白酶及肽酶的降解。

此外，抗菌肽还具有良好的热稳定性，特别是在酸性条件下，加热甚至是高温高压处理对其抗菌活性没有影响，因此不仅能够耐受饲料加工过程中高温高压的剧烈条件，并且可以在饲料保存过程中持续发挥其功能，保持饲料品质，延长贮存期限。抗菌肽做为新一代的绿色饲料添加剂，是很好的传统抗生素替代品，能有效得解决人和动物药残和病原菌耐药性的问题。

附图说明

图1是合成抗菌肽基因hkplp流程图。

图2是质粒载体pPIC3.5K的物理图谱。

图3是pPIC3.5K-PLP重组质粒载体的PCR鉴定，图中：M为DNA Marker DL2000；