[发明专利]一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括如下组分：

(1)组织样品的基因组DNA提取液；

(2)LAMP预反应液；

(3)BstDNA聚合酶；

(4)LAMP反应稳定液；

(5)LAMP反应显色液；

(6)阳性对照DNA；

(7)阴性对照DNA。

2.如权利要求1所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在于所述组分(1)包括组织裂解液和DNA吸附液。

3.如权利要求1所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在于所述组分(2)包括20～25mM pH为8.8的Tris-HCl、2～4mM硫酸镁、10～12mM氯化钾、10～12mM硫酸铵、1～1.25％TritonX-100、400～500μM dNTP、0.8～1.2M甜菜碱、0.8～1μM序列如SEQ ID NO.1所示的引物IHHNV-FIP、0.8～1μM序列如SEQ ID NO.2所示的引物IHHNV-BIP、0.2～0.4μM序列如SEQ ID NO.3所示的引物IHHNV-F2、0.2～0.4μM序列如SEQID NO.4所示的引物IHHNV-B3。

4.如权利要求1所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在于所述组分(3)为每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶。

5.如权利要求1所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在于所述组分(4)由矿物油或液体石蜡油组成。

6.如权利要求1所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在于所述组分(5)为含有10％SYBR Green I的荧光染料。

7.如权利要求1所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在于所述组分(6)为含有提取的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒基因组DNA。

8.如权利要求1所述用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在于所述组分(7)为含有提取的健康对虾基因组DNA。

9.一种使用权利要求1所述试剂盒检测IHHNV的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)待检样品DNA的提取：

A.取待检样品置于离心管中，加入组织裂解液，捣烂，室温裂解；

B.离心取上清，置于离心管中；

C.加入DNA吸附液，室温放置，期间摇匀；

D.离心，弃上清液，加入70％乙醇，上下颠倒混匀，使沉淀充分重悬起来；

E.离心，弃上清液，将沉淀放置于恒温金属浴中烘干，离心管盖打开；

F.加入ddH₂O，使用移液器上下吹打混匀，55℃放置，离心，上清液即为待检样品的DNA；

(2)传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP扩增：

A.根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数；

B.吸取LAMP预反应液，加入一洁净的离心管中，然后加入Bst DNA聚合酶，混合均匀，离心，得到混合液；

C.向反应管中分别加入上述混合液，然后在每个反应管中再分别加入LAMP反应稳定液，离心；

D.向上述反应管内按顺序依次分别加入阴性对照DNA、待检模板DNA和阳性对照DNA；

E.置恒温金属浴中于64℃恒温反应；

(3)显色检测：

取出LAMP反应管，冷却至室温，离心，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化。

10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)待检样品的DNA提取：

A.取待检样品25～30mg置于1.5ml离心管中，加入200μL组织裂解液，捣烂，室温裂解30分钟；

B.12000转/分离心3～5分钟，取上清，置于1.5ml离心管中；

C.加入15μL DNA吸附液B，室温放置5分钟，期间摇匀3次；

D.10000转/分离心20秒，弃上清液，加入200μL 70％乙醇，上下颠倒混匀，使沉淀充分重悬起来；

E.10000转/分离心30秒，弃上清液，将沉淀放置于60℃的恒温金属浴中烘干3～5分钟，离心管盖打开；

F.加入20μL ddH₂O，使用移液器上下吹打混匀，55℃放置5分钟，然后10000转/分离心30秒，上清液即为待检样品的DNA；

(2)传染性皮下及造血组织坏死病毒的LAMP扩增：

A.根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数N，N＝样品数+1管阳性对照+1管阴性对照；

B.吸取LAMP预反应液的体积为N×23μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NμLBst DNA聚合酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒；

C.向设定的N个反应管中分别加入24μL上述混合液，然后在上述每个反应管中再分别加入30μL LAMP反应稳定液，2000转/分钟离心5秒；

D.向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照DNA、待检模板DNA和阳性对照DNA各1μL，盖紧管盖并做好标记；

E.置恒温金属浴中于64℃恒温反应60分钟；

(3)显色检测：

取出LAMP反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入1μL显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化。