[发明专利]蝴蝶兰光周期相关基因PhalCOL的序列及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种在蝴蝶兰中表达的，与光周期相关的CONSTANS-like基因-PhalCOL基因、含有该基因的重组植物表达载体、含有上述重组植物表达载体的转基因植物转化体，以及PhalCOL基因在促进植物生长发育上的应用，还有应用原位杂交检测PhalCOL基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布的方法。

背景技术：

日照长度(即光周期)是影响开花时间的主要因素之一。拟南芥是一种典型的长日照植物，长日照能促进拟南芥开花，而短日照则会抑制开花。目前的研究发现，光周期途径中的主要调控基因有CONSTANS(CO)，CRY2/FHA，GIGANTEA(GI)，FT和FWA，它们的突变体在长日照(LD)条件下延迟开花，但在短日照(SD)条件下开花时间与野生型相似。

CO是植物光周期信号传导途径中的关键基因，在光受体和生物钟的共同调控下，基因表达量在一天之内呈节律性变化。Putterill等最早于1995年在拟南芥中找到一个比野生型开花延迟的突变体，然后采用图位克隆的方法分离到了CO基因，该基因在根和叶中表达，在长日照下CO促使拟南芥开花，但是短日照条件下不起作用。后来，Yano等在水稻中克隆到拟南芥的CO同源基因HD1，HD1突变后水稻对光周期的敏感性降低。

CO蛋白是一个转录因子，它不是决定植物开花的最终产物，而是通过调控下游基因FT和SOC1的表达控制开花时间。超表达CO基因后，FT和SOC1的表达量增加，开花时间提前，但是在FT突变体中超表达CO基因效果并不明显，说明CO是依赖于FT来调控植物开花时间。CO位于生物钟输出途径，在生物钟和开花时间之间起着纽带作用。

蝴蝶兰是兰科植物中栽培最广泛、最受欢迎的种类之一，花形似蝴蝶，别致美丽、色彩艳丽，花期长达数月之久，观赏价值极高，在热带兰中素有“兰花皇后”之美誉，国内外一直视其为花中珍品，倍受人们青睐。在我国，蝴蝶兰消费主要集中在春节、中秋、国庆、元旦等重大节日，生产上确保蝴蝶兰如期上市非常重要，花期调控是生产中的关键环节之一。影响蝴蝶兰生长发育与开花的因子有肥料、基质、温度、光照、激素等，生产上主要通过调控这几个因子来实现对蝴蝶兰的花期调控。

光照是影响蝴蝶兰花芽分化、花梗生长乃至开花的重要因素。Kubota等表明，冷处理中给以适当光照可诱导兰花产生花芽，完全黑暗下无花芽产生。曾爱平认为在一定的范围内，光照越强，抽梗率越大、花梗生长越快、花朵数越多、始花期越早；在蝴蝶兰栽培中特别是花芽分化期要给予充足的光照，否则抽梗率降低、花梗伸长缓慢、花期延迟。Vaz等研究指出在蝴蝶兰生长期间每天给予20h或更长的光照时间会严重影响其花芽分化，抑制开花并缩短蝴蝶兰的寿命。因此，在兰花的花期调节中应适时的给予适当的光照才能保证正常花芽的分化和开花，甚至提早开花。但光照影响蝴蝶兰开花的分子机理尚无报道。

发明内容：

本发明的第一目的是提供了一种在蝴蝶兰中表达的，与光周期相关的CONSTANS-like基因-PhalCOL基因、以及含有该基因的重组植物表达载体、含有上述重组植物表达载体的植物细胞系和植物转化体。

本发明的第二个目的是提供PhalCOL基因在促进植物营养生长和缩短开花时间中的应用。

本发明的第三个目的是提供了应用原位杂交检测PhalCOL基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布的方法。

本发明以蝴蝶兰杂交种“婚宴”(Phalaenopsis hybrida cv.Wedding Promenade)的花芽为材料，提取其总RNA，再将mRNA逆转录成cDNA第一链，以该cDNA第一链模板，根据PhalCOL基因保守区域设计引物进行PCR扩增，获得572bp的核心片段，根据RACE方法，设计引物，PCR扩增获得5’端和3’端序列，最后拼接获得全长cDNA序列，该cDNA序列长度为1202bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，其开放阅读框为自5’端第15位至第1001位碱基，共987bp，将此开放阅读框命名为PhalCOL基因，其编码的蛋白的氨基酸序列具有328个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为PhalCOL。