[发明专利]抑制人KCTD1基因表达的siRNA及其在制药中的应用

说明书

技术领域：

AP-2之间存在着直接的相互作用，而相互作用区域定位于AP-2的激活结构域和KCTD1保守的BTB/POZ结构域。细胞免疫荧光也表明两蛋白的定位完全重叠，都定位于细胞核中。并且发明人还发现在MDA-MB-453细胞中KCTD1强烈地抑制了AP-2的转录激活，而其它BTB/POZ蛋白(如PDIP1家族三个成员)并不影响AP-2的转录活性。因此如何根据KCTD1的这些特性来降低其转录抑制功能，从而达到抑制乳腺癌细胞的增殖进而抑制肿瘤是目前亟待解决的问题。

背景技术：

本发明的目的一是提供一种特异性抑制人KCTD1基因表达的siRNA，二是能产生上述siRNA的表达载体；三是上述siRNA或siRNA的表达载体在抗乳腺癌药物制备中的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

发明内容

一种特异性抑制人KCTD1基因表达的siRNA，其碱基序列及其作用部位如下：

正义链5’CGU CCC AGU UCA GCG AAU AdTdT 3’

反义链5’UAU UCG CUG AAC UGG GAC GdAdG 3’

作用于人KCTD1mRNA的第678-698位。

所述的siRNA，可以通过人工合成，该siRNA在3’有2-6个dT修饰或2-6个U修饰。

所述的siRNA在抗乳腺癌药物制备中的应用。

本发明以RNA干扰技术为基础，从GenBank获得人KCTD1基因的cDNA序列，根据siRNA靶序列选择的基本原则，针对KCTD1基因设计了21个核苷酸，在siRNA的3‘端添加两个脱氧核糖核苷酸(dTdT)呈单链悬挂结构，以增强此siRNA在体内和体外的稳定性，防止降解。本发明中所使用的siRNA由本发明人自己设计，委托上海吉玛公司通过化学法合成。

本发明所述的siRNA能高效特异性地抑制KCTD1基因的mRNA和蛋白水平的表达，不对其它BTB蛋白产生沉默作用。而该siRNA也特异性地缓解了KCTD1对转录因子AP-2转录活性的抑制，同时MTT分析表明KCTD1过表达促进了MDA-MB-453乳腺癌细胞的生长，而KCTD1-siRNA则抑制了乳腺癌细胞的增殖。

本发明以RNA干扰技术为基础，从GenBank获得人KCTD1基因的cDNA序列，根据siRNA靶序列选择的基本原则，针对KCTD1基因设计了21个核苷酸，在siRNA的3‘端添加两个脱氧核糖核苷酸(dTdT)呈单链悬挂结构，以增强此siRNA在体内和体外的稳定性，防止降解。本发明中所使用的siRNA由本发明人自己设计，委托上海吉玛公司通过化学法合成。

本发明所述的siRNA能高效特异性地抑制KCTD1基因的mRNA和蛋白水平的表达，不对其它BTB蛋白产生沉默作用。而该siRNA也特异性地缓解了KCTD1对转录因子AP-2转录活性的抑制，同时MTT分析表明KCTD1过表达促进了MDA-MB-453乳腺癌细胞的生长，而KCTD1-siRNA则抑制了乳腺癌细胞的增殖。软琼脂克隆形成实验结果也一致地显示KCTD1-siRNA加入后乳腺癌细胞形成克隆的数目急剧下降。因此，本发明可能提供一种全新作用机制的抗乳腺癌治疗方式和药物。

本发明的优点：

本发明提供的KCTD1-siRNA可以特异性抑制人KCTD1基因的表达，从而达到抑制乳腺癌的发生和生长的目的。该siRNA可用于制备特异性强的抗乳腺癌药物。

附图说明

图1：RT-PCR检测KCTD1 siRNA对KCTD1基因的mRNA水平的抑制

图2：Western Blotting检测KCTD1 siRNA对KCTD1蛋白水平的抑制

图3：Luciferase分析KCTD1 siRNA对AP-2的转录活性的影响

图4：MTT分析KCTD1 siRNA对乳腺癌细胞增殖的影响

图5：软琼脂克隆形成实验分析KCTD1 siRNA对乳腺癌细胞生长的影响

具体实施方式

实施例1：siRNA靶序列的选择