[发明专利]人类胚胎干细胞无饲养细胞培养体系培养基及培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种干细胞无饲养细胞无外源细胞因子培养体系的组成。

本发明还涉及一种干细胞的培养方法。

背景技术

目前，无论是hESCs所采用的主要培养体系都是和成纤维细胞共培养的方式^[1]，成纤维细胞所分泌的细胞因子对于胚胎多能性的维持起着至关重要的作用，国内外学者已经从成纤维细胞条件化培养基中鉴定出部分对维持胚胎干细胞未分化具有重要作用的细胞因子，其中就包括了Wnt信号通路配体Wnt3a^[2]，但是单独使用Wnt3a并不能维持hES处于未分化状态^[3]，成纤维细胞可能还分泌了其他的细胞因子，如FGF2，Nodal，Activin A等。随着人类胚胎干细胞无饲养细胞培养体现的建立，研究者发现Wnt信号通路抑制剂BIO或高剂量的FGF2可以维持人类胚胎干细胞体外培养^[4，5]，同时有研究表明人类胚胎干细胞可以分化成成纤维样细胞，这些成纤维样细胞可以分泌IGF2来维持人类胚胎干细胞的未分化状态，人类胚胎干细胞可以为自身建立一个维持未分化状态的微环境^[6]，这是人类胚胎干细胞为自身未分化状态维持的间接作用，但是人类胚胎干细胞作为培养体系的组成部分，人类胚胎干细胞直接对自身未分化状态的影响未见报道。由于人类胚胎干细胞高表达FGF2，Nodal以及IGF2基因^[7，8]，人类胚胎干细胞自分泌作用在自身未分化状态维持中具有重要影响。在2006年，国外学者Yao等同时采用了一种新的无饲养细胞培养体系，其加入的FGF2浓度由以往的40ng/ml降低到20ng/ml^[9]。该文献公开的无饲养细胞培养体系是：DMEM/F12，1×N2，1×B27，0.1mM β-ME，1×glutamine，在培养基中加入了胎牛血清，FGF2浓度为20ng/ml，同时采用的是Matrigel预铺皿，没有涉及克隆密度问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的人类胚胎干细胞无饲养细胞无外源细胞因子培养体系培养基，并用此培养基培养干细胞。

本发明提供的人类胚胎干细胞无饲养细胞无外源细胞因子培养体系培养基是由下列成分组成的：DMEM/F12，1×N2，1×B27，0.1mM β-ME。

本发明还公开了基于该培养基的培养人类胚胎干细胞的方法。即通过提高克隆种植密度可以在该培养体系维持人类胚胎干细胞不分化，并进行扩增。每个底面积为2.89cm²的孔板内克隆数目种植数目分别为80-120个。

在本人类胚胎干细胞无饲养细胞无外源细胞因子培养体系下，人类胚胎干细胞仍然保持了未分化特征，免疫细胞化学染色显示该体系下克隆为Oct4，SSEA-4和TRA-1-60阳性克隆(图1)，表达了多能性基因Oct4，Sox2，Nanog和Rexl(图2)，AKP染色阳性(图4)，在形态上保持了未分化外观：克隆内细胞排列紧密，细胞维持高核质比(图3)。

在本发明培养条件下的干细胞体系下，只要克隆种植密度维持在高水平状态，人类胚胎干细胞就可以维持未分化状态扩增，并且不存在背景分化现象，可以大规模扩增人类胚胎干细胞。由于在体系中不含有外源性的细胞因子，所以具有培养成本低廉的特定，同时，为阐明人类胚胎干细胞未分化状态提供了技术平台。

附图说明

图1免疫细胞化学染色显示该体系下克隆为Oct4，SSEA-4和TRA-1-60阳性克隆；

图2本发明培养条件下的干细胞体系表达了多能性基因Oct4，Sox2，Nanog和Rexl；

图3本发明培养条件下的干细胞体系在形态上保持了未分化外观：克隆内细胞排列紧密，细胞维持高核质比；

图4本发明培养条件下的干细胞体系AKP染色阳性。

具体实施方式

方法和步骤：

1、人类胚胎干细胞无饲养细胞无外源细胞因子培养体系培养基配方(NB培养基)；

利用DMEM/F12(11330057，DMEM NUTRIENT MIX F12，Gibco)N2 SUPPLEMENT(17502048，100×，Gibco)，B27 SUPPLEMENT(17504044，50×，Gibco)，β-ME(β-mercaptoethanol，Gibco)配置本发明提供的培养基：DMEM/F12，1×N2，1×B27，0.1mMβ-ME。