[发明专利]一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法及其专用芯片和试剂盒

权利要求书

1.一种基于等位基因特异性扩增的用于非诊断治疗目的的双探针基因突变检 测方法，包括如下步骤：以待检测的来自于人体组织的基因组为模板，用针对突 变位点设计的引物组和没有3’-5’端外切酶活性的DNA聚合酶进行多重等位 基因特异性PCR扩增，然后将得到的PCR产物与相应的根据该突变位点设计的 等位基因特异性探针进行杂交，根据杂交结果确定各基因位点的突变类型；其中

所说的引物组包括以下5条引物：野生型等位基因内引物Inner primer-W、 突变型等位基因内引物Inner primer-M、野生型等位基因外引物Outer primer-W、 突变型等位基因外引物Outer primer-M、特异性扩增辅助引物GC-primer；

所述等位基因特异性内引物的结构为：靠近其5’端的是一段长度为8-15nt 的由G和C组成的与模板DNA不匹配的序列；靠近其3’端的是一段包括17-30nt 的序列，且3’端最后一个碱基恰好位于待检测的一个基因突变位点上，与该位 点的突变型或野生型碱基匹配，其余碱基与突变位点前的相应片段完全匹配；

所述各个位点共用的特异性扩增辅助引物GC-primer是一段由G和C组成 的序列，该序列与所述等位基因特异性内引物的靠近5’端部分完全相同；

每个基因突变位点对应两组寡核苷酸探针，分别对应于野生型等位基因和突 变型等位基因，每组探针又包括一条长度为14-25nt的等位基因特异性短探针和 一条长度为50-70nt等位基因特异性长探针，所述的每个突变位点的野生型等位 基因特异性探针和突变型等位基因特异性探针分别与前面所描述的经等位基因 特异性扩增生成的包含该突变位点的野生型碱基和突变型碱基的核苷酸片段匹 配；所述等位基因基因特异性短探针与扩增片段上包含该基因突变位点的一段 序列匹配，所述等位基因基因特异性长探针与位于扩增片段上该基因突变位点下 游但不包含该位点的一段序列匹配；

所述的引物组中的内引物序列按照所选定的检测位点选自下列各组序列中 的一组或多组：SEQ ID NO.1和2；SEQ ID NO.3和4；SEQ ID NO.5和6；SEQ  ID NO.7和8；SEQ ID NO.9和10；SEQ ID NO.11和12；SEQ ID NO.13和14； SEQ ID NO.15和16；SEQ ID NO.17和18；SEQ ID NO.19和20；SEQ ID NO.21 和22；SEQ ID NO.23和24；SEQ ID NO.25和26；SEQ ID NO.27和28；SEQ  ID NO.29和30；SEQ ID NO.31和32；SEQ ID NO.33和34；

对应的等位基因特异性短探针序列按照所选定的检测位点选自下列各突 变位点所对应的短探针序列组中的一组或多组：SEQ ID NO：36和37；SEQ ID  NO：38和39；SEQ ID NO：40和41；SEQ ID NO：42和43；SEQ ID NO：44和45； SEQ ID NO：46和47；SEQ ID NO：48和49；SEQ ID NO：50和51；SEQ ID NO：52 和53；SEQ ID NO：54和55；SEQ ID NO：56和57；SEQ ID NO：58和59；SEQ ID  NO：60和61；SEQ ID NO：62和63；SEQ ID NO：64和65；SEQ ID NO：66和67； SEQ ID NO：68和69；

对应的等位基因特异性长探针序列按照所选定的检测位点选自下列各突变 位点所对应的长探针序列组中的一组或多组：SEQ ID NO：70和71；SEQ ID NO：72 和73；SEQ ID NO：74和75；SEQ ID NO：76和77；SEQ ID NO：78和79；SEQ ID  NO：80和81；SEQ ID NO：82和83；SEQ ID NO：84和85；SEQ ID NO：86和87； SEQ ID NO：88和89；SEQ ID NO：90和91；SEQ ID NO：92和93；SEQ ID NO：94 和95；SEQ ID NO：96和97；SEQ ID NO：98和99；SEQ ID NO：100和101；SEQ ID  NO：102和103；

特异性扩增辅助引物的序列为SEQ ID NO.35。