[发明专利]一种针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的构建及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医药技术领域。具体涉及一种针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体及其构建方法，并将这种病毒载体用于制备治疗慢性神经病理性疼痛的药物。

背景技术

(1)PKCγ基因是慢性神经病理性疼痛治疗重要的分子靶。

慢性疼痛不仅是医学界的一个难题，而且已成为社会经济的一大负担，据统计，全世界有三亿二千多万人受到慢性疼痛的困扰。神经病理性疼痛(Neuropathic Pain)是与多种周围神经障碍相关联的一组共同表现的症状，包括与糖尿病、甲状腺功能低下、尿毒症、营养缺乏和化疗药物(长春新碱、顺铂等)相关的神经障碍；也包括：格-巴二氏综合征、带状疱疹后神经痛、进行性神经病性肌萎缩病、复合性局部疼痛综合征I型和缺血性神经病变等(Gregory T，2001)。国际疼痛研究会(IASP，1994)将这种由于外周或中枢神经系统的直接损伤功能紊乱引起的疼痛称为神经病理性疼痛。神经病理性疼痛是医学领域的挑战性研究课题，目前发病机制不清，尚缺乏有效的治疗措施。近年来，对外周神经损伤所致的神经病理性疼痛的分子、细胞机制，特别是在初级感觉神经原和脊髓水平的研究积累了比较丰富的资料，为进一步研究提供了基础。

在外周神经受损引起的慢性神经病理性疼痛，常表现痛觉过敏、自发性疼痛、痛感觉异常等。众多研究表明：痛觉过敏等反应性增强过程可能与中枢敏感化有关，众多致痛性物质、神经递质以及其所引起的细胞内第二信使的变化在中枢敏感化的形成过程中可能发挥重要作用，尤其是蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)在其中起着关键性的作用。PKC是重要的细胞内信号转导分子，是磷酸脂依赖的丝氨酸和苏氨酸激酶异构酶，在细胞内信号转导起重要作用。PKC cDNA克隆的研究表明PKC包含一个超家族。其中PKCγ主要存在于大脑和脊髓中，研究表明PKCγ阳性神经元主要位于脊髓背角的II层内侧部及II、III层的交界处，而脊髓背角浅层(I、II层)是外周伤害性信息传递和调控的初级中枢，传递伤害性信息的Aδ纤维和C纤维多终止于I、II层，尤其是II层，它们在伤害性信息传递、整合过程中发挥重要作用。Hua等在结扎一侧坐骨神经的大鼠鞘内注射PKC抑制剂GF109203X，发现其具有明显的抗痛觉过敏效应，由此推断PKC在神经损伤诱发的痛觉过敏中发挥重要作用。Martin等在大鼠完全氟氏佐剂致痛模型中发现，在致痛侧L₄～L₅背角浅层各时间点PKCγ免疫性反应增加70～100倍，行为学表现为机械性痛觉过敏，上述结果提示：PKCγ免疫反应的持续性改变与机械性痛觉过敏相一致，痛觉过敏的维持依赖于PKCγ调节兴奋性中间神经元所致。Malmberg等发现.PKCγ基因敲除的小鼠发育正常，在坐骨神经结扎疼痛模型上，几乎不能形成神经痛但其急性痛行为正常，说明PKCγ在痛觉过敏中起关键性作用。国内万丽等报道对大鼠鞘内注射反义PKCγ寡核甘酸对慢性神经痛有明显镇痛效应，但是具体机制尚不清楚。因此PKCγ基因是慢性神经病理性疼痛治疗重要的分子靶。

(2)鞘内注射高转染效率的编码PKCγ基因shRNA重组慢病毒载体对NP大鼠的镇痛效应。