[发明专利]检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒

权利要求书

1.一种检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒依双抗原夹心ELISA原理研制而成，包括：

a.ELISA板条：每个试剂盒包含4块真空包装的ELISA板，每块板含可拆卸的已包被检测抗原的ELISA微孔板条，规格为8孔×12条；该包被抗原是依据GenBank中猪圆环病毒2型的登录号为AY943819的基因序列，设计两条引物，上游引物为：GCGAATTCATGGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC；下游引物为：GCGTCGACTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC；通过PCR的方法从猪圆环病毒2型基因组中扩增不含核定位信号的Cap基因，将其克隆到pET32-a(+)原核表达载体中，构建pET32a-Cap重组表达载体；转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，参照Novagen公司pET Syetem Manual表达重组Cap融合蛋白，用亲和层析法纯化表达的融合蛋白制得；

b.洗涤液：10倍浓缩的pH为7.4的含0.5％体积百分比吐温-20的1M磷酸盐缓冲溶液200ml；

c.100倍浓缩的酶标抗原500μl：将上述纯化的Cap融合蛋白用猪源肠激酶酶切去掉融合部分，并再次使用亲和层析柱纯化获得不含核内化信号肽的Cap蛋白，并用超滤管将其浓缩至2.0mg/ml，并采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶偶联于Cap蛋白上；

d.酶标稀释液：pH为7.4的0.1M磷酸盐缓冲溶液50ml；

e.底物显色液50ml：称取200mg四甲基联苯胺，用100ml无水乙醇或二甲基亚砜溶解后，以双蒸水定容至1000ml，配置显色液A；称取9.33g柠檬酸，14.6g磷酸氢二钠，加入0.75％质量体积比的过氧化氢尿素6.4ml，调pH值到5.0～5.4，双蒸水定容至1000ml，配制显色液B；显色液A、B等体积混合，即为显色剂；

f.终止液：2M硫酸溶液50ml；

g.标准猪圆环病毒2型阴、阳性血清各1.0ml。

2.如权利要求1所述的检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶偶联于Cap蛋白上，具体是于5mg/ml辣根过氧化物酶溶液中，加入0.2ml新配的0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟，用pH4.4的1mM醋酸钠缓冲液4℃透析过夜，加20μl 0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化的辣根过氧化物酶的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入2ml待标记的Cap蛋白至1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加0.1ml新配的4mg/ml NaBH₄液，混匀，4℃放置2小时，用pH7.4的0.15M磷酸盐缓冲液4℃透析过夜，在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃放置1小时后3000rpm离心半小时，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量PH7.4的0.15M的磷酸盐缓冲液中，用pH7.4的0.15M的磷酸盐缓冲液缓冲盐水透析，去除铵离子后，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶标抗原。