[发明专利]一种生长速度快且耐铀和耐氟能力强的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合表达藤黄微球菌赋活促进因子(resuscitation-promotingfactor，rpf)、新月柄杆菌cc3302基因以及秀丽隐杆线虫flr-4基因的氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株的制备方法及在铀矿浸出中的应用。

背景技术

氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，T.f)是重要的浸矿微生物之一，以氧化二价铁、元素硫以及还原态硫的化合物等来获得能量，在生长过程中产生三价铁、硫酸等浸出剂，因此能降低生产成本，同时，氧化亚铁硫杆菌能自我繁殖扩增，可以循环利用，这样就进一步降低了消耗。因此，利用氧化亚铁硫杆菌浸出金、银、铜、铀等的研究越来越受到重视。

虽然氧化亚铁硫杆菌有着上诉优点，但其缺点同样明显，主要体现在生长速度缓慢，高氟离子浓度下氧化能力降低甚至死亡，最适生长温度为30℃，在高温下活性迅速下降。

发明内容

本发明的目的是提供一种氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株Acidithiobacillusferrooxidans QEY-6(pJRD215-PT-rcf)，该菌株可以融合表达产生赋活促进因子、cc3302和flr-4，与野生型氧化亚铁硫杆菌相比生长速度更快，同时耐铀和耐氟能力有所提高，可以用于铀矿浸出工业应用。

本发明的另一个目的是提供制备具有表达能力的穿梭质粒pJRD215-PT的方法，该方法操作简单，能较好地解决用于氧化亚铁硫杆菌接合转移质粒只具有克隆功能的问题。

本发明还提供一种三基因(rpf、cc3302和flr-4)融合表达载体构建的方法，使用柔性极高的两段GGS链将这三段基因连接在一起与pJRD215-PT连接，降低了操作难度，且由于柔性GGS链的存在保证了各蛋白的正确折叠。

本发明还涉及氧化亚铁硫杆菌基因工程菌株Acidithiobacillus ferrooxidans QEY-6(pJRD215-PT-rcf)在铀矿浸出中的应用，可以提高对含氟铀矿石的耐受性，缩短浸铀周期，提高浸出率，降低耗酸率。

本发明的技术要点之一是穿梭表达载体pJRD215-PT构建。

氧化亚铁硫杆菌的转化目前主要使用接合转移方式，首先将构建好的重组接合质粒转化带mob基因的感受态大肠杆菌(如S17-1和HB101等)，然后制备2∶2接合培养基，将带重组接合质粒的大肠杆菌和氧化亚铁硫杆菌一起在接合培养基上孵育进行接合反应，收集细菌，转至带相应抗生素的2∶2固体培养基上培养，挑取单克隆扩增鉴定。但是目前应用于氧化亚铁硫杆菌的穿梭质粒均为克隆载体，需要先用软件预测目的基因的启动子，将目的基因与启动子一起扩增后克隆入穿梭质粒。这存在几个问题，首先启动子预测软件对启动子的预测不准确，不同软件预测的结果相差较大；其次，做不同的基因均需要进行预测，增加了工作量和难度。

本发明的一个实施例中提供了一种制备具有表达能力的穿梭质粒pJRD215-PT的方法，该方法包括：扩增引物合成，pJRD215和pQE30质粒的提取，T5启动子和T0终止子的扩增，目的基因片段的回收，测序鉴定。

(1)扩增引物合成：根据Qiagen公司提供的pQE30质粒序列设计PCR寡核苷酸扩增引物。T5启动子上游引物：GGCGTCGACCTCGAGAAATCATAAAAAAT(下划线处为内切酶SalI位点)，下游引物：TATCTAGA ACCCGGGGTACCGAGCTC(下划线处为内切酶XbaI位点)，T0终止子上游引物：GTTCTAGATAATTAGCTGAGCTTGGACTC(下划线处为内切酶XbaI位点)，下游引物：GGGAATTCATTCTCACCAATAAAAAACGCC(下划线处为内切酶EcoRI位点)。

(2)pJRD215和pQE30质粒的提取：平板划线培养过夜，挑取单克隆接种于液体培养基中培养，集菌后按照全式金公司的EasyPure Plasmid MiniPrep Kit的说明书提取质粒。将提到的质粒溶液储存于-20℃备用。

(3)T5启动子和T0终止子的扩增：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环，72℃再延伸10分钟。