[发明专利]一种介导基因转染的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学及生物工程学领域，涉及有关基因治疗的的基因运载体系技术。具体涉及一种介导基因转染的方法。

背景技术

随着人类基因组计划的完成，治疗基因的选择已不再成为难题。基因治疗目前已成为恶性肿瘤及一些先天性疾病或慢性疾患的极具潜力的一种治疗方法。有关研究表明，基因治疗整个过程主要涉及目的基因，基因转移技术和受体细胞三方面。在受体细胞一定的情况下，基因转移技术是决定基因治疗效果的关键。基因转移技术平台的优劣又取决于外源基因能否高效、安全地进入组织细胞，且在组织细胞内稳定持久表达。

现有技术公开的基因转移技术分为病毒性和非病毒性载体两种。较常用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，其各有优缺点。逆转录病毒介导基因表达稳定持久，但对非分裂期细胞感染效果差，存在种属特异性，在人体使用的毒副作用较大。腺病毒虽能感染分裂期和非分裂期细胞，但反复转导会触发严重的机体体液及细胞免疫反应，无法用于临床试验。腺相关病毒较其他已有病毒载体安全性较好，迄今尚未发现野生型和重组型AAV与人类疾病有关；它能感染分裂及非分裂期细胞；它的内源性弱启动子对外源基因的调控无明显的干扰作用，而且启动的方向不指向宿主细胞的DNA，因此插入突变的危险性相当低。但AAV迄今应用范围不广，仅见在神经组织、视网膜组织、肝脏、心肌、骨骼肌、肺组织中报道，其主要原因之一是AAV制备滴度尚低，而达到理想表达效果的感染复数(multiplicityof infection，MOI)一般较高，在1×10⁵～1×10⁷(v.g./cell)范围内；其二，AAV对组织细胞有一定的嗜向(tropism)特异性，对非嗜向性的组织细胞AAV转染效率低下。

较绝大多数的病毒载体来说，非病毒性载体以安全性的优势日益受到学者们重视。其中，超声靶向破坏微泡(Ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)是近年来一项新的快速发展的介导基因转染方法，现已有应用于实验动物多种实质器官和疾病模型的基因转染研究，取得了安全的转染效果。这种转染方法的机制是以微泡作为空化核，在超声交变声压作用下，产生瞬间空化效应引起细胞膜通透性增加及产生非致死性可逆开闭的声孔，与微泡结合的基因通过声孔进入细胞发挥作用。UTMD技术较其他现有的非病毒载体技术(脂质体、电穿孔、纳米粒子)的显著优势在于①可调节：声孔效应的程度与超声辐照的声压、声强、频率、工作周期、照射时间及微泡剂量等因素有关，根据靶组织的不同来调节这些参数，可在转染效率提高的同时使组织损伤减少到最小；②瞬间可逆增加体内屏障通透性：UTMD技术可使细胞膜、血管壁及体内屏障产生瞬间可逆的通透性增加，所以可从血液内注射外源基因来进行转染；③超声辐照的靶向性：超声辐照本身具有器官组织靶向性，可使辐照局部基因转染效率增加。

但UTMD有其应用缺陷，一是转染效率仍较低，二是转染效果存在一过性。所以，为了使治疗基因实现在组织或细胞内的高效安全转染及长期稳定表达，有必要采取新的策略来改进已有的基因运载体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种介导基因转染的方法，为基因治疗提供一种新型、安全、高效且能介导目的基因长期表达的基因转移技术方法。

本发明采用超声靶向破坏微泡(简称：UTMD)技术联合腺相关病毒载体介导基因转染，特别使UTMD技术以合适的辐照剂量条件、时间及方式与腺相关病毒rAAV2载体联合共同介导基因转染，实现安全高效且基因长期表达的效果。

本发明所解决的主要问题是通过UTMD技术显著增加rAAV2载体进入靶细胞的数量即效率。其核心是通过选择合适时间，以一定剂量微泡吸附携带rAAV2载体，同时根据不同的细胞或组织来调控超声辐照条件，达到安全高效介导病毒载体进入细胞或组织的同时对细胞或组织的破坏最小。

本发明的技术方案通过以下方法和步骤实现：

1.确定UTMD联合AAV介导基因转染方法的实施方式，包括确定联合顺序、时间间隔以及微泡与病毒载体混合方式；

2.优化UTMD联合AAV转染方法介导基因转染效果，包括调控超声声强、辐照时间、微泡剂量、重复超声辐照的时间间隔及辐照剂量；

3.UTMD联合AAV在体内、外实验中介导基因转染，包括在不同肿瘤细胞、正常细胞及动物模型。