[发明专利]一种酵母表达的长效重组人组织因子途径抑制物

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及长效组织因子途径抑制物(LTFPI)的高效表 达。更具体地，本发明涉及野生型组织因子途径抑制物(TFPI)的糖基化和C 末端4个关键受体结合位点进行突变，以及全长LTFPI基因密码子优化、基因克 隆、基因表达、蛋白纯化和功能测定。

背景技术

组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)是丝氨 酸蛋白酶抑制物，主要由微血管内皮细胞合成，具有较强的抗凝活性，分子量 42～48KD，含有3个N-糖基化位点和一个潜在的在酵母中可能糖基化的位点， 分别是117N、167N、228N、174S和175T。由于糖基侧链的差异，TFPI分子量 不尽相同。研究证实糖基化及糖基化程度的差异并不影响其抗凝活性。由于酵母 的糖基化与人体有差异，因此如果应用酵母表达TFPI，则应去除糖基化位点， 以免引起免疫反应。

TFPI前体含有28个氨基酸残基组成的信号肽，成熟蛋白质分子含276个氨 基酸残基，由富含酸性氨基酸的N端、3个串联的Kunitz型结构域和富含碱性 氨基酸的C端组成。3个Kunitz型结构域依次称为K1、K2和K3，K2可以与FXa 直接结合并抑制其活性，FXa/TFPI复合物通过K1与FVIIa/TF结合，形成 FVIIa/TF/FXa/TFPI四元复合物，从而抑制FVIIa/TF的活性，发挥抗凝活性。

TFPI的C末端能与肝细胞低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)结合，然后进 入肝细胞后代谢分解，因此TFPI与LRP的结合与其清除半衰期短有关。野生型 TFPI由于半衰期甚短，严重地限制了它的使用。现有技术研究发现，TFPI C末 端269、282、288和289位赖氨酸在两者的结合中发挥关键作用，这四个位点被 中性的丙氨酸替换后，TFPI与LRP的结合能量显著下降，血浆清除半衰期延长 了4倍左右，这种突变后的TFPI称为长效TFPI(long half-time TFPI，LTFPI)。

应用大肠杆菌表达的LTFPI以包涵体形式存在，获得有活性的目的蛋白需要 经过变复性等繁杂过程，最终得率很低。而使用CHO、BHK和C127等哺乳动物细 胞表达LTFPI，存在操作烦琐、表达量低和成本昂贵等缺点，不能满足实验室研 究、临床前研究和将来临床应用的需要。

毕赤酵母是一种高效蛋白表达系统，但是否表达目的蛋白，以及表达蛋白的 水平与目的蛋白的结构密切相关，有些蛋白能够获得高效表达，而有些蛋白完全 不能表达。有关基础研究的实验显示LTFPI不能在毕赤酵母中获得表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种酵母表达的长效重组人组织因子途径抑制物。

本发明应用基因工程和蛋白质工程对LTFPI(ZL 03151203.8)糖基化位点 和羧基端位点进行突变；利用生物信息学软件，根据毕赤酵母密码子特点对 LTFPI基因序列进行优化，从而使毕赤酵母高效表达有良好抗凝活性的LTFPI。

本发明的另一目的是建立毕赤酵母高效表达无糖基化、半衰期长、具有抗凝 血活性的LTFPI制备方法。

按照此种方法获得的LTFPI具有序列1的结构，在毕赤酵母中能获得高效 表达，纯化后的LTFPI具有良好的抗凝功能。

本发明实验证实，只有对LTFPI的编码基因进行毕赤酵母密码子偏好性改变 后，才能获得高效表达。

本发明在现有技术的基础上，保留将TFPI的羧基末端赖氨酸替换为丙氨酸 可以延长其半衰期的方法不变，进一步突变3个糖基化位点和一个可能的在酵母 中被糖基化的位点。

本发明在LTFPI序列改变的基础上，对编码基因密码子序列进行了一系列 的优化。

本发明利用重叠PCR法，以野生型TFPI基因为模板，设计了能够优化密码 子的10对引物，分别具有序列3-22的结构，获得具有酵母密码子偏好性的序列 2的LTFPI基因。

本发明将优化后的LTFPI基因与相关质粒重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定 筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证修改后的LTFPI基因是否正确。

本发明将优化TFPI基因序列与表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明 不限于特定的表达质粒。在一优选实施方案中，本发明使用的是pPIC9K。