[发明专利]一种透皮结构域及其衍生的具有透皮作用的融合蛋白和其制备方法

说明书

技术领域

本发明属基因工程领域，具体涉及一种蛋白透皮结构域与两种抗氧化作用的蛋白分别形 成的融合蛋白，以及该类融合蛋白在制备抗氧化药物中的应用。

技术背景：

长久以来，生物个体为了保护自己免受病微生物、病毒等的侵害，形成了多重防护体系， 第一层防护就是皮肤。皮肤由表皮和真皮构成，在表皮外有角质层覆盖，能够阻挡细菌、病 毒等绝大多数大分子物质的进入；另一层防护就是细胞本身。细胞膜对于绝大多数物质是不 透的，使其免受有害物质的损伤，保持其功能的完整性。

在正常情况下，蛋白质由于分子量较大，是不能透过细胞膜阻挡，进入细胞质甚至细胞 核中的。蛋白质转导是近年发展起来的一种将外源蛋白导入细胞的方法。将某些特殊的多肽 与靶物质共价相连后，这些多肽会连同靶物质一起，进入临近细胞。这种由多肽携带靶物质 跨过细胞膜的阻挡，进入细胞质的过程称为蛋白转导(protein transduction)。这些能携 带外源物质进入细胞的多肽成称蛋白转导结构域(protein transduction domain，PTD)。

蛋白转导结构域是一些富含赖氨酸、精氨酸的蛋白结构域多肽。他们与共价的所需要的 目的基因产物相连后，这些目的基因产物就会被带到细胞中，发挥应有的生物学功能。目前 利用该方法已经高效地将绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶、Caspase-3等等多种大 分子多肽带到细胞中。目前最常用的蛋白转导结构域共价偶连方法是将目的基因与蛋白转导 结构域基因相融合，最后产生赋予了新的转导能力的目的蛋白。

同样，表面疏水的角质层对于分子量大的蛋白质同样有阻隔作用。小分子化合物能够扩 散进入皮肤，但是一方面由于分子量太大，另一方面由于含有亲水氨基酸，因而难以透过角 质层的阻挡，进入皮肤中。目前能介导蛋白质透皮的物质是表面疏水脂质体等，但是包封率 有限。蛋白转导结构域的机理是通过其表面正电荷与细胞后接触后被吞噬进入细胞。这样的 机理对于皮肤细胞摄取蛋白质也许同样适用。

超氧化物歧化酶(SOD-1)和人血红素加氧酶(HO-1)等都是人体内重要的抗氧化酶，在清 除自由基，保持细胞内环境稳定中发挥着重要作用。然而当人体皮肤受到氧化损伤或者紫外 线照射时，不仅表皮层会受到损伤，真皮层也会受到损伤(紫外线中的UVA主要损伤真皮层)。 外源补给的这些抗氧化酶并不能穿透角质层细胞膜进入到细胞中，清除自由基，保护细胞， 这大大降低了这些酶的应用价值。

发明内容：

本发明的目的正是从蛋白转导结构域中筛选到具有透皮能力的结构域，我们称之为透皮 结构域，从而弥补了超氧化物歧化酶(SOD-1)、人血红素加氧酶(HO-1)不能透过角质层进入 皮肤细胞发挥抗氧化作用的不足。将寡聚赖氨酸、精氨酸编码序列分别与人SOD-1、HO-1基 因融合后表达，使得这些抗氧化酶具有了新的功能-能够进入皮肤中进行的抗氧化作用。研 究表明，该类融合蛋白既能进入细胞中，也能透过大鼠角质层、表皮层和真皮层，并显示很 好的抗氧化能力。

本发明的融合蛋白通过下述方式获得：

1、分别扩增超氧化物歧化酶(SOD-1)、人血红素加氧酶(HO-1)基因

根据已知的人的SOD-1、HO-1基因的mRNA序列，设计引物，用RT-PCR扩增出这三种基因 的cDNA序列。扩增产物酶切后连接到表达载体中(比如Novagen公司的pET-28a，分别构建成 为pET-SOD-1、pET-HO-1上述载体经酶切鉴定及测序检测，序列正确。

2、构建融合蛋白基因

透皮结构域的核苷酸序列采用寡核苷酸合成。分别合成两条链引物，5’- CGGGATCCAGGAGGAGGAGGAGGAGGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGCTTCCC-3’(核酸序列如SEQ ID NO： 4所示)，以及5’-GGGAAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTGGATCCCG-3’(核 酸序列如SEQ ID NO：5所示)，上述两条引物含有透皮结构域编码基因以及BamHⅠ和Hind Ⅲ的酶切位点和保护碱基。引物退火后分别连接BamHⅠ和HindⅢ双到酶切后的pET-SOD-1 和pET-HO-1载体中，构建成为pPD-SOD-1和pPD-HO-1上述载体经测序检测，序列正确。

3、融合基因在大肠杆菌中的表达