[发明专利]一种调控植物衰老进程中叶绿素降解的关键基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种参与叶绿素降解调控的关键新基因CRN1及其应用。本发明还提供了一种创建滞绿植物品系的方法，以及一种筛选/鉴定滞绿植物品系的分子辅助育种方法。

背景技术

植物叶片进入衰老程序后，由于叶绿素的快速降解所导致的黄化现象，是几乎所有植物绿色器官衰老的共同、也是最显著的表观特征。虽然叶片衰老可以被许多环境因子和发育因子诱导，但是叶片衰老开始的时间以及过程都是被细胞凋亡过程所调控。在过去数十年中，学者们在许多作物上发现了叶片绿期延迟至成熟或衰老之后，即滞绿(stay-green)或非黄化(non-yellowing)突变体。

根据Thomas，H和Howarth，C.J.(J.Exp.Bot.，51：329，2000)的分类，滞绿突变体可以分为五种基本类型。A型滞绿突变体的衰老启动推迟，但是衰老的速率不变；B型滞绿突变体衰老启动正常，但是叶片黄化和光合速率下降减缓。由于这两类滞绿突变体的光合期被延长，因而被称之为“功能型”滞绿。C型滞绿突变体中叶绿素降解功能由于遗传变异导致的异常，叶绿素含量可以长期维持不变；但是，就生理功能退化而言，与野生型无异。因此该类突变体被称之为“非功能型”滞绿，或“表观”滞绿。D型滞绿突变体是由于速冻或骤干所引起的叶片死亡所致。最后一种为E型突变体，在该种突变体内积聚过量的叶绿素，使得叶片呈深绿色，但光合效率维持不变。D型、E型与C型一样，也为“非功能型”滞绿。

叶绿素降解代谢途径上的三个关键酶基因中(叶绿素酶基因，脱镁叶绿酸氧化酶基因，RCC基因)，只有脱镁叶绿酸氧化酶基因显示出了一定的调控衰老叶片中叶绿素降解的潜力，但是该基因的突变和被过度抑制会引起有毒中间产物的积累，进而导致叶片上出现类似于创伤引起的坏死斑点(S.Annu.Rev.Plant Biol.57：55-77，2006)。

迄今为止，研究得最广泛、最深入的滞绿突变体是草地羊毛(Festuca pratensis)滞绿突变体及其衍生遗传材料(Thomas，H.，Planta，137：53，1977；Thomas，H.，Planta，154：212，1982；Thomas，H.，Theor.Appl.Genet.，73：551，1987；Thomas，H.&Matile，P.，Phytochemistry，27：342，1988)。该突变体是一种自然发生的变异体，受核内单隐形位点(sid)的调控；属于非功能型突变。与野生型相比，在衰老叶片中有明显的脱植醇叶绿素酸酯、羟基叶绿素酸酯和脱镁叶绿酸的积累；而且，叶绿素捕光结合蛋白(light harvest chlorophyll-binding protein)的稳定性也显著地增加。但是，可溶性蛋白，特别是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)大亚基的降解速率没有差异。

在大豆中，滞绿性状受到三个核基因(G和d1d2)和一个胞质基因(cytG)的控制(Guiamet，J.J.，et al.，Plant Cell Physiol.，31：1123，1990)。一个显性基因G使种皮维持绿色。一个胞质基因，cytG和两个隐性基因，d1d1d2d2和G_d1d1d2d2调控叶片、果荚、种皮和胚中的绿色色素。据报道，cytG的突变可使得衰老叶片中的叶绿素b比叶绿素a更加稳定，因而抑制了叶绿素的降解。d1d1d2d2纯合突变可使衰老叶片中叶绿素和可溶性Rubisco蛋白的降解显著延迟(Guiamet，J.J.et al.，Plant Physiol.，96：227，1991；Guiamet，J.J.etal.，Physiol.Plant.，96：655，1996)

在干菜豆(Phaseolus vulgaris)的滞绿突变体中，也报道了衰老叶片中叶绿素滞留的现象(Backmann，A.et al.Biochem.Bioph.Res.Co.203：1362-1362，1994)。但是，在突变体中既没有发现叶绿素酶活性的改变，也没有检测到脱镁叶绿酸的积累。然而，相比于野生型，突变体中的叶绿素酸酯a和b的确有积累，表明脱镁螯合酶活性可能存在缺陷(Fang，Z.，et al.J.Exp.Bot 49：503-510，1998)。

在水稻上，也筛选到了受单隐形核基因调控的滞绿突变体sgr(t)，并被定位在9号染色体长臂上的RFLP标记RG662和C985之间(Cha et al.，TAG.104：526-532，2002)。