[发明专利]雷莫拉宁发酵液预处理的方法

说明书

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种雷莫拉宁发酵液的预处理的方法。

背景技术

随着抗生素在抗感染治疗上的大量应用，临床耐药问题日益突出。雷莫拉宁(RAMOPLANIN)作为一类新型广谱抗革兰氏阳性菌抗生素，目前主要是作为外用和治疗胃肠道粘膜表面感染性疾病药物进行研究开发。

雷莫拉宁由一种游动放线菌属菌种(美国标准菌库保存，代码ATCC33076)制得。其传统的预处理方法是将ATCC33076发酵菌株发酵出来的发酵液先调pH到3.5，离心得到菌丝体和发酵液，其中菌丝体用有机溶剂进行提取，提取后真空浓缩，再用正丁醇萃取多次，合并萃取液后再反复用石油醚对其进行沉淀并分离出来，真空干燥得到粗品，而发酵液用正丁醇萃取，同样方法制得粗品。

USP4328316中报道的雷莫拉宁的预处理方法是通过高速离心，使发酵液和菌丝体分开，再分别处理发酵液和菌丝体。此法的缺点是必须使用价格昂贵的大型离心设备，且由于雷莫拉宁发酵液的黏度很大，固液分离的效果不好，另外，由于必须对发酵液和菌丝体分别处理，操作步骤繁琐，溶剂使用量大，非常不利于工业化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种步骤简单、操作时间短，并同时保持高收率的预处理雷莫拉宁发酵液的方法。

本发明基于将絮凝作用应用到雷莫拉宁发酵液的预处理中，通过筛选各种絮凝剂、摸索其加入发酵液的比例而完成。

絮凝作用的原理是在絮凝剂存在的条件下，在悬浮粒子之间产生架桥作用而使发酵液中的胶粒物质形成粗大的絮凝团，从而使得发酵液易于过滤。对于雷莫拉宁发酵液，由于其菌丝形态的特异性，粘度非常大，无论是抽滤还是离心都难以取得很好的效果，加入本发明的絮凝剂后，由于产生的架桥作用，使得发酵液中粘度较大的蛋白质胶体物质聚集成块，因而能够大大增加了过滤的速度。

本发明通过筛选各种絮凝剂，找到两种絮凝效果非常好的絮凝剂，并优选出最佳的添加量。加入本发明絮凝剂后，原来非常粘稠的发酵液变得非常的容易过滤，直接通过布氏漏斗即可快速的将固液分离开，从而避免了大型离心机处理过程烦琐，离心时间长的问题。

另外，本发明通过对发酵液pH的考察，发现将发酵液的pH调到8～10后，再加入絮凝剂，过滤后雷莫拉宁将完全在菌丝体中，滤液中几乎没有单位。对于菌丝体可以用有机溶剂将雷莫拉宁提取出来。和已有专利相比，此工艺免去了从菌丝体和滤液分别提取雷莫拉宁，只需对菌丝体进行处理，从而简化了工艺。

因此，本发明提供一种雷莫拉宁发酵液预处理的方法，该方法包括如下步骤：

a)将雷莫拉宁发酵液的pH调节到8-10；

b)向发酵液中加入絮凝剂；

c)过滤；

d)提取滤饼中的雷莫拉宁。

其中，a)步骤中雷莫拉宁发酵液的pH可用NaOH溶液进行调节；b)步骤中所述的絮凝剂优选为亚铁氰化钾和硫酸锌，所述亚铁氰化钾和硫酸锌加入的量优选为所述雷莫拉宁发酵液体积的0.2～1％，这里絮凝剂的加入量最少要0.2％，但并不限定最大用量，选择1％为上限是出于成本的考虑，1％已经完全能够很好的过滤雷莫拉宁发酵液；c)步骤中的过滤方式优选为抽滤；d)步骤中滤饼中的雷莫拉宁可用一定体积的有机溶剂例如甲醇、乙醇或丙酮等提取。

本发明的雷莫拉宁发酵液预处理的方法具体根据如下步骤进行操作：

1)将雷莫拉宁的发酵液放罐后用NaOH溶液调其pH到8-10，搅拌后静置1h左右；

2)向发酵液中加入絮凝剂(优选亚铁氰化钾和硫酸锌)，加入的量可以为0.2～1％(体积百分比)，搅拌后静置0.5h；

3)用布氏漏斗进行抽滤，抽滤时间视发酵液的体积而定，对于几升的发酵液来说，二十分钟内完全能够抽滤好；

4)抽滤完后弃去滤出液，将滤饼用一定体积的有机溶剂(优选甲醇、乙醇、丙酮等)将其提取出来。

本发明的雷莫拉宁发酵液预处理的方法具有步骤简单、操作时间短以及收率高的优点。

具体实施方式

本发明所述的雷莫拉宁发酵液由以下方法制得：将保藏号为ATCC33076的发酵菌株进行发酵，其中：

斜面培养条件：斜面及平板培养基(g/L)：牛肉膏3.0，酪蛋白10.0，可溶淀粉24.0，葡萄糖1.0，琼脂22.0，灭菌前pH 7.0，121℃灭菌30min。菌种接种于斜面培养基，于30℃培养5-9天。