[发明专利]一种利用基因工程方法增强烟草抗冻性能的方法

说明书

技术领域

本发明属分子生物学、酶学、生理学、育种学以及基因工程等领域。涉及一种利用基因工程技术提高烟草抗冻性能的方法，具体涉及利用莨菪AOC基因的cDNA构建高效植物表达载体和工程菌株在烟草中表达该基因、筛选转化子、验证抗冻性能的具体程序。

背景技术

茉莉酸类物质是植物界中普遍存在的一种激素，参与植物发育和逆境胁迫下应激反应的信号传导过程。内源和外源的茉莉酸类化合物能显著提高植物对机械损伤、动物撕咬、病虫害侵染、低温、高盐等不利外界环境的耐受能力。在植物中，茉莉酸类物质的合成途径是从细胞膜上释放的亚麻酸开始，在脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化物环化酶、OPDA(12-oxo-(10，15Z)-phytodienoic acid)还原酶、β-氧化酶、茉莉酸甲基化酶等一系列酶的催化生成茉莉酸和甲基茉莉酸。其中由于丙二烯氧化物会自发水解，由此丙二烯氧化物环化酶的作用在茉莉酸类物质的合成途径中尤为重要。

作为一种重要的模式植物，且易于进行遗传转化，烟草是植物的信号途径研究中的热门对象；作为一种广泛种植的经济作物，烟草的抗逆性能在物种品质和经济价值上具有非常重要的意义。烟草的抗冻研究目前涉及β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)蛋白，超氧物岐化酶(SOD)蛋白等。

相比较而言，利用来源于莨菪的茉莉酸类物质合成途径的关键酶丙二烯氧化物环化酶的基因工程来系统性地提高烟草的抗冻性能具有很大的优势：(1)在茉莉酸类物质的合成和信号传导研究领域，全世界的研究人员已经进行了几十年的深入研究，其生理作用和生化机制比较清楚，为在基因工程中利用茉莉酸类物质生物合成途径的基因打下了良好的理论和实践基础。(2)莨菪是一种和烟草亲缘关系非常相近的茄科植物，来源于莨菪的丙二烯氧化物环化酶可以在烟草中顺利表达并达到高活性效果。

目前，尚未有任何与本专利申请中所提及的应用基因工程技术把莨菪的茉莉酸物质生物合成途径的酶基因尤其是丙二烯氧化物环化酶转到烟草中，提高烟草抗冻性能的相关报道，包括专利和文献。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种利用基因工程技术提高烟草抗冻性能的方法，该方法将来源于莨菪的丙二烯氧化物环化酶基因转到烟草中。

本发明的第二目的是提供一种高效表达载体，它包含上述莨菪的丙二烯氧化物环化酶基因片断。

本发明的第三目的是提供一种用上述高效表达载体转化的宿主细胞。在本发明实例中该宿主细胞是烟草。

本发明还提供利用基因工程获得的提高了抗冻性能的烟草细胞和植株及其培养的子代、再生植株、植物组织或种子。

本方法的目的通过下述技术方案实现：

本发明分离出的DNA分子具有编码丙二烯氧化物环化酶的核苷酸序列的核心片断，该核心片断来源于由申请人在GenBank中登录的莨菪丙二烯氧化物环化酶基因(AY708383)的核苷酸序列，用引物P1(5’-GA ACTAGT ATG GCT ACT GCT TCC TCA G-3’，SpeI酶切位点用下划线表示)和P2(5’-GC GGTGACC TCA ATT AGT GAA ATT TTT CAG-3’，BstEII酶切位点用下划线表示)，采用PCR法可以从莨菪cDNA文库中扩增出该核心片断，莨菪丙二烯氧化物环化酶基因的cDNA序列如SEQ IDNO1：(莨菪(Hyoscyamus niger)丙二烯氧化物环化酶基因，全长1045bp，Genbank登录号AY708383，开放阅读框位置为第71位碱基到第817位碱基)。

本发明公开了一种利用转基因技术提高烟草抗冻能力的方法，其特征在于利用具有编码莨菪丙二烯氧化物环化酶的核苷酸核心片断的表达载体，采用任何转基因方法在烟草细胞、组织、器官、植株中表达：

其步骤如下：

(1)采用任何可能的手段(如基因克隆、人工合成基因等方法)获得莨菪丙二烯氧化物环化酶基因的核心片断；

(2)把莨菪丙二烯氧化物环化酶基因核心片断可操作地连于表达调控序列，形成表达载体；

(3)采用任何转基因方法转移莨菪丙二烯氧化物环化酶基因核心片断到烟草细胞、组织、器官、植株中；

(4)在特定的条件下筛选和鉴定转化子；

(5)在适合的条件下培养抗冻性能提高的烟草转化子，获得转基因后代。

本发明涉及的载体包含具有编码莨菪丙二烯氧化物环化酶的核苷酸序列的核心片断的DNA。

用上述方法获得的生命体，它是抗冻性能提高了的烟草的细胞、组织、器官、植株。