[发明专利]一种利用不同程度的连续易错PCR进行定向进化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术蛋白质工程研究领域，尤其涉及一种利用不同程度的连续易错PCR进行定向进化的方法。

背景技术

定向进化(Directed evolution)是近年发展起来的一项新技术，是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成的进化过程。

定向进化技术运用最为广泛的两种技术是易错PCR(error prone PCR)和DNA改组(DNAshuffling)，其核心思想是随机地改变编码蛋白质的基因序列，获得文库，然后通过大量的筛选从文库中获得正向进化的目的基因。其中易错PCR是一种简便快速地在DNA序列中随机制造突变的方法，它通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。此种方法的关键在于选择适当的突变频率，当突变频率太高时，几乎无法筛选到有益突变；若突变频率太低，野生型将占据突变群体的优势，也很难筛选到理想的突变体。一般来说，合适的突变频率是每个序列2～3个碱基或1个氨基酸残基突变。由于一轮易错PCR往往很难获得满意的结果，因此常用连续易错PCR方法，将一次PCR扩增得到的有利突变基因作为下一次扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小突变积累而产生重要的有益突变。本发明引入了高、中、低三种不同程度的易错PCR同时突变，以达到特定突变频率以及获得一定数量的筛选突变库。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用高中低不同程度的连续易错PCR快速高效进行定向进化的方法，该方法通过添加不同剂量的Mg²⁺、Mn²⁺，以及改变体系中dATP、dTTP、dCTP、dGTP碱基的添加浓度比例，增加错配率，操作简单，突变频率高、产量稳定，可为定向进化蛋白质提供新的思路和途径。

本发明所提供的利用不同程度的连续易错PCR进行定向进化的方法，包括如下步骤：

(7)选择目的基因为模板设计引物；

(8)配制高、中、低不同程度的d[X]TP易错PCR体系；

(9)将配制好的PCR反应体系放入PCR仪中进行PCR扩增；

(10)将易错PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳回收，进行酶切、与载体连接、转化，进行阳性克隆筛选，提取质粒；

(11)以提取的质粒为模板，重复步骤(1)～(4)进行第二轮易错PCR；

(12)重复步骤(5)，利用相应筛选系统进行有用突变的筛选。

步骤(2)所述的低等突变程度的易错PCR体系中：25mmol/L Mg²⁺的终浓度为0.25mmol/L，5mmol/L Mn²⁺的终浓度为0.05mmol/L，10mmol/L d[X]TP的终浓度为1000μmol/L。

步骤(2)所述的中等突变程度的易错PCR体系中：25mmol/L Mg²⁺的终浓度为0.5mmol/L，5mmol/LMn²⁺的终浓度为0.1mmol/L，10mmol/L d[X]TP的终浓度为1500μmol/L。

步骤(2)所述的高等突变程度的易错PCR体系中：25mmol/L Mg²⁺的终浓度为1.0mmol/L，5mmol/L Mn²⁺的终浓度为0.2mmol/L，10mmol/L d[X]TP的终浓度为2000μmol/L。

步骤(2)所述的PCR体系中，所用聚合酶为Taq酶。

步骤(3)所述的PCR反应条件为：94℃3分钟变性和酶激活，94℃ 45秒变性，58℃ 30秒30秒退火，72℃90秒延伸，循环35次；最后72℃ 10分钟延伸。

步骤(4)所述的琼脂糖凝胶电泳分析使用TBE buffer，胶浓度为1.0％，凝胶回收试剂盒使用Qiagen公司产品。

本发明利用高中低三种不同程度连续易错PCR的方法，可有效控制突变频率，获得一定大小的突变库。本发明操作简单，突变频率高，产量稳定，可控性强，结合相应筛选手段，为定向进化改造蛋白质提供新的思路和途径。

附图说明

图1实施例1的易错PCR琼脂糖凝胶电泳结果，M为marker，P为阳性对照；

图2实施例2的western blot检测突变体剪接活性，