[发明专利]一种检测鱼类精子质膜损伤的方法

说明书

技术领域

本发明属水产养殖技术，涉及到鱼类精子质膜损伤的检测方法。

背景技术

在养殖生产中常常需要对鱼类进行催产繁育，鱼类精子质量的好坏是繁育中非常重要的一个环节，直接影响受精率、孵化率和成活率。鱼类精子排出体外后，其活力容易受到外界各种环境因子的影响，不同的环境条件(温度、光照等)都会对精子造成一定损伤，从而影响精子的质量，降低受精率、孵化率和成活率，给养殖生产带来极大损失。精子质膜是包在精子头部外面的一层膜，具有丰富的膜蛋白，在受精过程中起着非常重要的作用，但这层膜对外界环境因子极为敏感，容易受到损伤导致破裂或脱落。目前检测鱼类精子质膜损伤的方法是通过扫描电镜和透射电镜进行观察，但这种方法只能从外观进行定性观察，不能定量分析和统计，且仪器价格昂贵。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种检测鱼类精子质膜损伤的方法。

本发明采集一定数量的鱼类新鲜精子和经过低温处理的精子，其特征是将新鲜精子和经过低温处理的精子分别收集到10mL的离心管中，800×g离心5min，弃去上清液，用缓冲液稀释，使待测样本精子数为(2～3)×10⁵·mL^-1；

加入2uL胰蛋白酶消化5min，然后用缓冲液洗涤2次，800×g离心5min，再用缓冲液重新悬浮精子，使精子细胞浓度为1-2×10⁵·mL^-1；取195μL精子悬液，加入5μLAnn-FITC，在室温下孵化10min，然后加入10μLPI染液，室温下避光孵育10-15min；利用FACSCalibur型流式细胞仪检测，流式细胞仪氩离子激发光波长为488nm，光源为200mw；用Cel-lquest 9.3版检测每个精子的前向角散光和侧向角散光；用波长为520nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于610nm的滤器检测PI；在精子凋亡早期位于质膜内侧的磷脂酰丝氨酸迁移至质膜外侧，可与一种钙依赖性的磷脂结合蛋白V相结合；因此，将Annexin V标记上荧光素可以作为探针检测暴露在质膜外侧的磷脂酰丝氨酸；同时结合使用碘化吡啶PI进行双染色后，用流式细胞仪即可检测质膜完整的正常活精子、质膜损伤的凋亡精子及质膜完全破裂的坏死精子。

本发明与现有技术相比，本发明通过采用荧光双染法对受到不同损伤的精子进行染色，经过前处理后直接用流式细胞分析仪进行检测，可定量区分质膜完整的精子和质膜不完整的精子，结果更直观，更可靠。

具体实施方式

在鱼类的繁殖季节，采集一定数量的鱼类新鲜精子和经过低温处理的精子，将这2份精子分别收集到10mL的离心管中，800×g离心5min，弃去上清液，用缓冲液(Annexin V-PI检测试剂盒，美国BD公司)稀释，使待测样本精子数为(2～3)×10⁵·mL^-1。

加入2μL胰蛋白酶消化5min，然后用缓冲液洗涤2次，800×g离心5min，再用缓冲液重新悬浮精子，使精子细胞浓度为1-2×10⁵·mL^-1。取195μL精子悬液，加入5μL Ann-FITC(Annexin V-PI检测试剂盒，美国BD公司)，在室温下孵化10min，然后加入10μLPI染液，室温下避光孵育10-15min。利用FACSCalibur型流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)检测，流式细胞仪氩离子激发光波长为488nm，光源为200mw。用Cel-lquest 9.3版(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)检测每个精子的前向角散光(ESC)和侧向角散光(SSA)。用一波长为520nm的通带滤器检测FITC荧光(FL1)，另一波长大于610nm的滤器检测PI(FL3)。在精子凋亡早期位于质膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至质膜外侧，可与一种钙依赖性的磷脂结合蛋白V(Annexin V)相结合。因此，将Annexin V标记上荧光素可以作为探针检测暴露在质膜外侧的磷脂酰丝氨酸。同时结合使用碘化吡啶PI进行双染色后，用流式细胞仪即可检测质膜完整的正常活精子、质膜损伤的凋亡精子及质膜完全破裂的坏死精子。

质膜有损伤的精子DNA可被PI染色产生红色荧光，质膜保持完好的精子则不会有红色荧光产生。因此，在双变量流式细胞仪的散点图上，上方两个象限为PI阳性，表示精子质膜不完整，为非活性精子；下方两个象限精子质膜完整，为活性精子。每个待测样本检测200个精子，计算待测样本质膜完整率。

运用此方法能准确检测鱼类精子的质膜损伤，可对质膜的完整率进行量化，结果更直观，更可靠，检测准确率达到99％以上。