[发明专利]一种编码产碱杆菌腈水解酶的基因及其用于制备扁桃酸单一对映体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种编码腈水解酶的碱基序列，一种含有这种碱基序列的质粒， 以及由这种质粒转化而得到的转化体。本发明还涉及一种可以催化扁桃腈高效且 对映选择性水解为(R)-(-)-扁桃酸的基因工程重组腈水解酶，以及使用这种酶由 相应的扁桃腈制备(R)-(-)-扁桃酸及其类似物的技术方法。本发明还涉及利用这 种转化体制备(R)-(-)-扁桃酸及其类似物的方法。本发明另外还涉及通过利用腈 水解酶的转化体、其培养物或者其加工制品来催化扁桃腈的不对称水解制备相应 的(R)-(-)-扁桃酸单一对映体及其类似物的方法。

技术背景

扁桃酸，或称α-羟基苯乙酸，是一种重要的手性合成中间体和大宗手性拆分 剂，在制药行业具有广泛的用途。相对于扁桃酸的消旋体，其单一对映体(右旋 或左旋的扁桃酸)的应用价值更高。因此，简洁高效、低成本的扁桃酸单一对映 体的制备方法成为研究开发的热点。

(R)-(-)-扁桃酸及其类似物是一类重要的手性合成砌块，被广泛地应用于多 种药物的合成。例如，作为头孢类半合成抗生素、抗肿瘤及抗衰老药物的重要中 间体；也可以作为手性拆分试剂，用于拆分其他的手性药物或医药中间体。

(R)-(-)-扁桃酸的化学结构式为：

传统的化学拆分法，主要是利用手性胺类化合物，如α-甲基苄胺、(-)-麻黄 碱和辛可宁等，通过与外消旋的扁桃酸形成非对映异构体盐的方法，得到扁桃酸 的单一对映体。还可利用色谱法、结晶法、膜法和超临界萃取法等物理化学方法 来对扁桃酸进行对映体拆分。此外，还可利用还原剂来不对称合成(R)-(-)-扁桃 酸。

最近，利用生物法合成(R)-(-)-扁桃酸正在逐渐成为研究的热点。例如，专 利报道(CN 1710087，2005)以苯甲酰甲酸甲酯或苯甲酰甲酸的其它衍生物为底 物，采用酵母或白地霉等微生物细胞作为催化剂，选择性地将底物中的羰基还原 为羟基，从而获得以一种立体构型为主的扁桃酸单一对映体。专利(CN 1840671， 2006)以筛选到的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AS 1.818作为催化剂，不对 称转化外消旋的扁桃酸得到产物(R)-扁桃酸，产物的光学纯度可达90％e.e.以上。 也有文献报道利用脱氢酶选择性降解(S)-(+)-扁桃酸而得到(R)-(-)-扁桃酸。例如， Miyamoto等(Biotechnol.Lett.，1992，14：1137-1142)利用Alcaligenes bronchisepticus 拆分外消旋的扁桃酸，产率为42％，e.e.为97％。Jamaluddin等(J.Bacteriol.，1970， 101：786-793)利用Aspergillus niger脱氢酶选择性氧化外消旋的扁桃酸得到光学纯 的(R)-(-)-扁桃酸。Takahashi等(J.Ferment.Bioeng.，1995，3：247-250)利用 Pseudomonas polycolor转化外消旋的扁桃酸，得到(R)-(-)-扁桃酸，产率为35％， e.e.为99.9％。Li GY等(Process Biochemistry，2007，42：1465-1469)利用壳聚糖固定 化Saccharomyces cerevisiae来不对称还原苯甲酰甲酸为(R)-(-)-扁桃酸，产率为 62％，e.e.为98％。

然而，上述公开报道的方法一般仅限于实验室规模，还不适用于工业化生产 (R)-(-)-扁桃酸，主要是由于还原催化剂或拆分试剂价格昂贵，物理化学方法技 术要求严格，而在生物化学方法中需要先合成其转化的前体，其步骤相当繁琐且 反应条件剧烈，对生态不够友好，同时还需要消耗昂贵的辅酶。

腈水解酶能够催化有机腈化合物一步水解为羧酸并产生一分子的氨，该过程 反应条件温和，不需要任何辅因子的参与，反应效率极高，同时反应过程具有较 好的区域和立体选择性。另一方面，反应底物扁桃腈易于大规模生产且成本低廉； 更为重要的是，当(R)-(-)-扁桃腈被对映选择性地酶促水解为(R)-(-)-扁桃酸后， 剩余的(S)-(+)-扁桃腈在弱碱性条件下可以自发地消旋转化为外消旋的扁桃腈，这 样理论上可以得到100％的产率。因此，如果能够获得对扁桃腈具有高水解活性 和对映选择性的腈水解酶，则有望实现(R)-(-)-扁桃酸的大规模工业化生产。