[发明专利]线粒体基因耳聋相关突变位点及用途

说明书

技术领域

本发明属基因组学领域，涉及遗传性疾病的相关基因，具体涉及线粒体基因耳聋相关新突变位点tRNA His 12201T＞C及其用途。

背景技术

遗传性耳聋是一种严重影响生存质量的常见疾病，临床实践显示，目前尚无有效药物与治疗方法，故预防该遗传性耳聋的发生显得至关重要。研究显示，遗传性耳聋的遗传方式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、性连锁遗传和母系遗传。线粒体DNA是独立于细胞核染色体外的基因组，仅通过女性向下一代传递，男性则不再下传。

研究显示，线粒体基因突变可引起多种疾病，线粒体基因突变引起的耳聋即呈现母系遗传的特点。1993年Prezant等发现线粒体DNAA1555G突变是导致携带此突变的个体对氨基糖甙类抗生素高度敏感产生耳聋的主要因素，自此对母系遗传性耳聋的病因学研究有了突破性进展。此后，研究相继发现C1494T、A7445G、7472insC、T7510C、T7511C等与耳聋相关的线粒体DNA突变。

线粒体遗传的母系遗传特性导致特定人群携带致病突变及发病，根据这一特点通过系统的线粒体DNA突变筛查发现阳性个体并进一步对其家族中未发病的母系家庭成员进行防聋宣教，制定预防策略，具有积极的社会意义和经济意义。

发明内容

本发明的目的是提供线粒体基因新突变及其用途，特别涉及线粒体基因耳聋相关新突变位点12201T＞C及其在线粒体基因突变导致耳聋的基因学诊断中的用途。

本发明提供的线粒体基因新突变为12201T＞C。12201T＞C位于线粒体tRNA His(位于线粒体12138-12206)上，所述的12201由胸腺嘧啶(T)突变为胞嘧啶(C)。其所在序列为GTAAATATAGTTTAACCAAAACATCAGATTGTGAATCTGACAACAGAGGCTTACGACCCCTTACTTACC，具有序列1的结构。该序列为人类线粒体tRNA His基因全部序列，其中加下划线的字体为突变位点。

本发明所述的线粒体基因耳聋相关突变通过下述方法和步骤获得：

1.采集标本：在医院就诊的门诊病人中调查获得一母系遗传性耳聋家系，进行家系调查、病史采集、体检、测听、收集该家系成员外周静脉血，进行基因检测(经伦理委员会批准，家系成员签署知情同意书后)；

2.全基因组DNA的抽提：按血液基因组DNA抽提试剂盒操作说明进行操作，试剂盒为PAX gene^TM Blood DNA Kit；

3.序列分析

(1)采用经典的24对线粒体引物分别进行PCR扩增，所得PCR产物片段相互重叠，可覆盖线粒体全序列；

4.PCR扩增

PCR反应体系为30ul，含基因组DNA模板100ng，正反向引物各3pM，10×PCR Buffer 3μl(含Mg²⁺)，dNTPs 300nM，Taq 1u；

扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s(引物1、23、24退火温度为60℃，引物2、11退火温度为58℃，引物3～10、12～17、22退火温度为59.7℃，引物18、21退火温度为54.8℃，引物19、20退火温度为58.1℃，)，72℃延伸30s，30个循环后72℃延伸7min终止反应。

5.PCR产物纯化(上海英骏生物技术有限公司)后直接测序；

6.测序结果用GeneTool软件与人类线粒体标准序列(经过校正的人类线粒体DNA剑桥参考序列，Human Mitochondrial DNA RevisedCambridge Reference Sequence)进行比对，发现可疑的突变位点后用Chromas基因阅读软件读取测序结果的峰图文件，进行确认或排除。同时用Chromas软件阅读全部测序峰图，以免遗漏异质性突变。

7.采用GeneTool软件完成蛋白编码区上的由于碱基突变导致的氨基酸变化的分析。