[发明专利]一种纳米金生物复合探针、检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳米金生物复合探针、检测方法及其应用，特别是一种 基于纳米金与镧系元素组成的纳米生物复合探针、高灵敏检测的方法，及其 在同时检测多种生物分子方面的应用。属于生物检测技术领域。

背景技术

能够对生物分子简便、快捷、高选择性、高灵敏度地检测，始终是人们 努力的方向，在疾病的早期诊断、快速诊断、卫生检测、环境监测等领域都 具有重要意义。根据不同的标记手段，人们开发了一系列有效的检测方法， 如放射性标记、荧光标记、酶标记等。不同标记方法有不同的优点和缺点， 受示踪剂性状的限制，酶标记灵敏度不高，检测范围受限，而放射性标记虽 然比较灵敏，但存在一定放射性污染的问题，荧光标记是目前的一种主导的 检测方法。20世纪80年代初Pettersson等和Eskola等创立的一种非放射性标 记免疫分析技术，与传统的荧光素标记不同，它是以镧系元素，如铕(Eu)、 铽(Tb)、钐(Sm)、镝(Dy)等的螯合物为标记物。镧系元素螯合物与普通荧光 素相比具有许多独特的荧光特性：激发光谱带宽；发射光谱带窄；激发光与 发射光之间的Stoke’s位移大，可达290nm，而普通荧光素的Stoke’s位移仅 28nm；镧系元素螯合物的发射光能持续数百个微秒，而普通荧光素只能维持 数个纳秒；镧系元素螯合物荧光寿命长，没有自发猝灭现象，不受光漂白的 影响等。在时间分辨荧光仪上测量时，脉冲光源激发后，可适当延迟一段时 间，待其他短半衰期(1～10ns)的非特异荧光完全衰变后再测量，从而极大 的降低了本底荧光，提高检测灵敏度。并且铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)、镝(Dy) 这四种荧光的发射波长差异非常明显，适用于同时多种标定的实验。

随着纳米科学技术的不断发展，纳米材料和纳米结构取得了引人瞩目的 成就，为生物医学的发展提供了新的契机。纳米材料具有传统材料所不具备 的特有的三大效应：表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。尤其是纳 米金由于具有容易制备、良好的生物相容性和相对较大的比表面积等特点， 在生物体系中的应用引起了广大研究者的关注。纳米金可通过物理吸附、静 电吸附、特异识别、共价结合等方式与蛋白质、核酸、糖等结合构建的纳米 金生物复合探针，本发明拟利用纳米金的这一特性以及与生物分子具有高选 择催化性与自我识别的性质，可广泛用于蛋白质、核酸、糖以及金属离子等 各方面的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于纳米金与镧系元素螯合物构建的纳米 生物复合探针的检测方法以及在同时检测多种生物分子方法的应用。

本发明提供的纳米金生物复合探针的特征在于所述的纳米金生物复合 探针是一种基于纳米金与镧系元素组成的纳米金生物复合探针，纳米金标记 待测蛋白的检测抗体，同时还标记一种带有生物素标记的DNA探针，纳米 金上的DNA探针通过生物素-链霉亲和素反应，使镧系元素接到纳米金上 构建而成。

本发明提供的检测方法主要内容包括：首先用待测蛋白质的单克隆捕捉 抗体标记磁珠，然后在纳米金上标记上待测蛋白的单克隆或多克隆待测抗体， 同时还标记一种带有生物素标记的DNA探针，纳米金上的DNA探针通过生物 素-链霉亲和素反应，使镧系元素接到胶体金上，构建成纳米金生物复合探针， 最后将标记好待测蛋白质单克隆捕捉抗体的磁珠及纳米金生物复合探针与待 测蛋白质样品混合，37℃孵育一段时间，洗去没有反应的纳米金探针，加入 增强液，测荧光强度，从而达到对待测蛋白质进行定量测定的目的。

本发明提供的检测方法具体步骤为：

1.用待测蛋白质的单克隆抗体标记磁珠制成磁珠探针

选用羧基修饰的磁珠，按常规方法活化磁珠，加入待测蛋白质的单克隆 捕捉抗体，抗体浓度为10～100μg/mg磁珠，混匀，室温放置半小时。再用 PBS(含质量百分数为0.1-0.5％BSA和质量百分数为0.01-0.1％Tween-20)洗 数次，按所需浓度重悬磁珠，2-8℃储存备用。

2.制备纳米金生物复合探针

a.确定抗体的最佳用量用K₂CO₃溶液将纳米金溶液的pH值调到8.5～ 9，取不同量的抗体加到1ml纳米金溶液里，室温静置5分钟，再加入NaCl 溶液，确定蛋白的最佳用量。稳定1ml纳米金溶液红色不变的最低蛋白质用 量，即为该标记蛋白质的最佳用量。