[发明专利]一种提高乙型肝炎病毒X蛋白免疫效果的蛋白制备方法

说明书

技术领域本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种提高蛋白免疫效果的蛋白制备方法。

背景技术乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一种嗜肝DNA病毒，基因组约含有3200个核苷酸，呈双链不完全环形结构。HBV DNA的短链不编码任何蛋白，长链有4个开放性读框(ORF)，即S区、C区、P区和X区。S区编码前S1、前S2和S三种外壳蛋白；C区编码HBcAg蛋白和信号肽；P区基因编码DNA聚合酶；X区基因的产物是X蛋白。

HBV X蛋白日益引起人们的重视，有研究发现HBV X蛋白不仅可以反式激活HBV基因的所有启动子，也可反式激活宿主的原癌基因，并且X基因与宿主基因组的整合与肝癌的发生有密切联系。但是在实际研究中尚缺乏特异有效的检测HBV X蛋白的抗体，主要原因在于X基因是HBV最小的基因开放读码框，编码的X蛋白仅有16.5kD，非常难以纯化，并且在原核表达系统中表达水平也很低，最终其免疫原性非常弱，免疫动物后难以获得针对X蛋白的特异性抗体。

本发明采用两个HA标签串联两个X蛋白，成为X-HA-HA-X结构，增加了免疫原的蛋白大小，易于在原核系统中进行表达和纯化，同时也丰富了免疫原的空间结构，将纯化后的X-HA-HA-X蛋白免疫动物后，再分别用HA-X和pelB-X蛋白筛选抗体，可获得多个高效价的特异性抗X蛋白单克隆抗体。该方法结果可靠，简单有效，适用于难以在原核系统表达的低分子量蛋白的表达、纯化和抗体制备。

发明内容本发明的目的就是提供一种能简便、高效地进行HBV X蛋白在原核系统中的制备工艺。该发明使得X蛋白易于表达和纯化，增强了X蛋白的免疫原性，增加了抗X蛋白抗体的多样性。该发明简单易行，适用于低分子量蛋白的表达、纯化和抗体制备。

本发明的内容主要由三部分组成。

1、融合X-HA-HA-X蛋白、HA-X蛋白、pelB-X蛋白的重组基因构建。

设计X基因上下游引物时，引入HA标签或pelB标签的基因，通过聚合酶链式反应(PCR)将X基因与HA基因或pel基因连接起来(见说明书附图1)。通过限制性内切酶将X-HA-HA-X、HA-X、pelB-X分别插入原核表达载体的多克隆位点，测序确认基因序列准确插入。

2、融合X-HA-HA-X蛋白、HA-X蛋白、pelB-X蛋白的原核表达和纯化。

按照原核表达系统的操作方法诱导表达X-HA-HA-X融合蛋白，破碎原核细胞，离心后使上清液缓慢通过带有抗标签抗体的柱子，目的蛋白被吸附在柱子上，洗去杂蛋白后，洗脱获得目的蛋白。融合HA-X蛋白和pelB-X蛋白按同样方法诱导、表达、破碎、离心，取裂解上清液待用。

3、抗HBVX抗体的制备与筛选。

单克隆抗体制备：将融合X-HA-HA-X蛋白与佐剂充分乳化后免疫BALB/c小鼠，2周后加强免疫一次，第4周再免疫一次。拉颈处死小鼠，经75％酒精消毒后，在无菌环境下取小鼠脾脏，将脾脏研碎，过不锈钢筛网，制备脾细胞悬液。将事先准备好的骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例均匀混合，用聚乙二醇(PEG)溶液融合，用不完全培养液终止融合反应，更换HAT选择培养液，维持一周后换用HT培养液，维持两周后，再改用一般培养液，尽量保持每孔有一个克隆细胞群生长，取克隆细胞分泌的上清液进行抗体筛选。

抗体检测方法：将纯化的X-HA-HA-X包被96孔板，加入克隆细胞分泌的上清液孵育1小时后，用PBST洗涤，加HRP标记的兔抗鼠IgG，孵育半小时，用PBST洗涤，加底物显色，通过酶标仪读取OD₄₀₅值。

抗体特异性筛选：阳性的单克隆抗体进一步用ELISA或Western Blot筛选。与HA-X、pelB-X蛋白均有反应的为抗X蛋白阳性克隆；与HA-X有反应，与pelB-X无反应的为抗HA阳性克隆。只与X-HA-HA-X发生ELISA反应的，是识别空间表位的抗体。

将阳性克隆细胞挑选出来，进行大规模培养，制备腹水，即可获得大量抗X蛋白抗体。具体实施方式通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出X-HA-HA-X、HA-X、pelB-X基因，插入原核表达载体pET-28a(带有His标签)的多克隆位点，测序确认是否正确插入。