[发明专利]荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法，该方法依次包括如下步骤：

A)根据待检测的HPV基因的特异性核酸序列分别合成13对引物，上下游引物之间相距50～200个碱基；

B)并根据各型HPV基因的特异性核酸序列中位于两个引物之间的序列分别设计、合成Taqman荧光探针；、

C)使用步骤A)中的引物和步骤B)中的荧光探针荧光反应体系，其中镁离子的浓度为1～10mM，Taq聚合酶0.1～5U，各种引物及探针浓度为10～500nM；

D)从待测临床标本中提取DNA，取适量加入步骤C)中的反应体系中，经离心混合后将反应管放入实时定量PCR反应仪，进行20～50次循环扩增反应，反应结束后测定反应管中的荧光增值；

E)同时用系列阳性和阴性模板也进行D)的核酸提取反应，测得各自相应的代表荧光增值的循环数(Ct值)，根据Ct值算出目的基因相对含量(算法详见后述)，并将其相对于阳性模板的初始核酸量做图，制作标准曲线；

F)用上述步骤中获得的各样品Ct值计算得出的目的基因的相对含量即可在标准曲线上查出相应的样品中的核酸起始拷贝数。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤A)中所述的两个引物之前相距73～104个碱基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤D)中所述的PCR反应进行30～50个循环。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤D)中所述的PCR反应进行35～45个循环。

5.一种用于荧光定量PCR定性检测高危型HPV方法的试剂盒，它包括：荧光PCR反应液，阳性模板，阴性模板以及根据待测核酸的特异性核酸序列设计的PCR引物和荧光引物，该荧光PCR反应液中镁离子的浓度为1～10mM，Taq聚合酶0.1～5(0.625)U。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸分别为HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV58，HPV59，HPV67，及内参照基因HMBS。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性核酸序列在NCBI中的序列编号分别为：HPV16 NC001526，HPV18 NC001357，HPV31 J04353，HPV33 M12732，HPV35 M74117，HPV39 M62849，HPV45 X74479，HPV51 M62877，HPV52 X74481，HPV56 X74483，HPV58 D90400，HPV59 X77858，HPV67 D21208，HMBS M95623.1。