[发明专利]CK19单克隆抗体、其制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学和生物医药领域。更具体而言，本发明涉及抗CK19单克隆抗体的制备及其用途。

背景技术

细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)是构成细胞骨架的一种中间丝状物，几乎所有上皮细胞均可被其表达，用双相胶电泳可将人类上皮细胞角蛋白分离出20个条带，分别命名为CK1～20，用单抗进行免疫组化分析证实20种不同的角蛋白多肽在组织的分布具有特异性。当上皮细胞癌变时，CK组成不变但含量异常升高，20个细胞角蛋白中许多成员的片段已作为肿瘤的血清学标志物，肿瘤细胞中含量最丰富的是CK19，临床上多以CK19和CK20作为靶基因。其中细胞角蛋白19片断(CK19)的研究最为引人注目。

CK19属酸性(I型)细胞角蛋白，分子量为40kDa，是单层上皮细胞特有的细胞骨架结构，在所有的单层上皮细胞中表达，在淋巴结和血细胞中不表达。CK19mRNA基因定位于人染色体17q21～q23，编码细胞角蛋白19亚型。作为循环上皮细胞的一个标志物，它也是早期癌症微转移研究中运用最多的分子标志之一。CK19与CK7一起被称为胆管型CK。CK19对肝细胞不着色，对胆管上皮和胆管癌(ICC)具有特异性染色，是目前诊断ICC最好的免疫组化标志物。

目前，临床上用的针对CK19的抗体主要是用MCF-7细胞系免疫动物制备而来的，该方法制备工艺繁琐，筛出特异性抗体的难度较大，成本相对较高。

因此，本领域迫切需要开发出可简单有效地生产高纯度、高亲和力CK19单克隆抗体的方法，以及由该方法提供的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的之一正是在于提供一种生产CK19单克隆抗体的方法。本发明的领域目的在于提供由本发明方法制备的CK19单克隆抗体及其用途。

在本发明的第一方面中，提供了一种CK19特异性单克隆抗体，所述的抗体的亚型为IgG1，κ。

在本发明的一个实施方式中，所述单克隆抗体由选自下组的杂交瘤细胞株产生：CCTCC-C200923、CCTCC-C200924或CCTCC-C200925。

在本发明的另一优选例中，所述的单克隆抗体特异地累积于胆管上皮或胆管癌中。

在本发明的另一优选例中，所述的单克隆抗体是用原核系统表达的CK19抗原免疫动物制得的。

在本发明的第二方面中，提供了一种产生CK19特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，其选自：CCTCC-C200923、CCTCC-C200924或CCTCC-C200925。

在本发明的第三方面中，提供了一种制备本发明单克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)构建特异性表达CK19蛋白的原核表达系统；

(b)由所述原核表达系统产生CK19蛋白；

(c)用步骤(b)中所产生的CK19蛋白免疫动物；

(d)用被免疫动物的脾细胞制备特异性表达CK19的杂交瘤细胞；和

(e)从步骤(d)的杂交瘤细胞中制得本发明所述的单克隆抗体。

在本发明的一个实施方式中，所述原核表达系统是大肠杆菌表达系统。

在本发明的另一个实施方式中，所述方法还包括在步骤(d)之前，对CK19蛋白进行纯化的步骤。

在一个优选例中，纯化所用的方法是包涵体变性纯化，且在用8M尿素溶解包涵体之前先用2M尿素洗涤包涵体，再用8M尿素溶解包涵体Ni柱亲和纯化，从而使得纯化所得蛋白的纯度高于未用2M尿素洗涤的纯化所得的蛋白。

在本发明的第四方面中，提供了一种制备CK19特异性单克隆抗体的方法，所述的方法包括步骤：

(1)培养杂交瘤细胞系CCTCC-C200923、CCTCC-C200924或CCTCC-C200925，使之分泌单克隆抗体；

(2)分离步骤(1)中获得的单克隆抗体。

在本发明的第五方面中，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有本发明的单克隆抗体，以及选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶。

在本发明的第六方面中，提供了一种检测条或检测试剂盒，其含有本发明的单克隆抗体、本发明的免疫偶联物、或它们与可检测标记物的结合物。

在一个优选例中，所述可检测标记物选自：胶体金标记、荧光标记、同位素标记、酶标记，优选所述酶标记为HRP酶标。

在本发明的第七方面中，提供了本发明单克隆抗体或本发明免疫偶联物在制备用于检测样品中CK19存在的检测条或检测试剂盒中的用途。