[发明专利]一种基于上转换发光技术定量检测AFP的免疫层析试纸

权利要求书

1.一种基于上转换发光技术定量检测AFP的免疫层析试纸，是以上转换发光材料作为生物标记物的双抗夹心式免疫层析试纸，其特征在于：作为生物标记物的上转换发光材料是表面经过氨基化修饰的，以NaYF₄为基质、Yb³⁺为敏化剂、Yb和Er共掺杂的NaYF₄:Yb:Er纳米颗粒，所标记的生物活性分子为AFP抗体。

2.根据权利要求1所述的基于上转换发光技术定量检测AFP的免疫层析试纸，其特征在于：所述NaYF₄:Yb:Er纳米颗粒的直径为100～400nm。

3.一种权利要求1所述的基于上转换发光技术定量检测AFP的免疫层析试纸的制备方法，包括：UCP-生物活性分子结合物的制备、样品垫的制备、结合垫的制备、分析膜的制备、免疫层析试纸条的组装共5个步骤，其特征在于，各步骤的具体操作如下：

a)UCP-生物活性分子结合物的制备

将表面经过氨基化修饰的NaYF₄:Yb:Er纳米颗粒加入到pH＝7.2的0.03mol/L的磷酸盐缓冲液(PB)中，配制成浓度为1～2mg/ml的悬浊液；向其中加入25％的戊二醛，于15～30℃下反应2～4小时，戊二醛与表面经过氨基化修饰的NaYF₄:Yb:Er纳米颗粒的质量比为(100～500)∶1；离心洗去多余的戊二醛，然后分散在0.03mol/L的PB中，配制成浓度为1～2mg/ml的悬浊液；再向其中加入AFP抗体，于3～5℃反应2～4小时，AFP抗体与表面经过氨基化修饰的NaYF₄:Yb:Er纳米颗粒的质量比为1∶(200～1000)；在3～5℃离心洗涤数次，即得UCP-生物活性分子结合物，保存于0.03mol/L的PB(含0.1％BSA，0.1％Tween20)中；

b)样品垫的制备

选用纤维素膜作为样品垫材料，剪成1.5×30.0cm规格的条带，将其放入样品垫封闭液(pH＝7.2的0.03mol/L PB，含有5mg/mlBSA，0.1％Triton X-100)中浸泡30min，然后于37℃烘干备用；

c)结合垫的制备

选用玻璃纤维素膜作为结合垫材料，将其剪成1.0×30.0cm规格的条带；离心步骤a)制备的UCP-生物活性分子结合物中的保存液，然后向沉降物中加入pH＝7.2的0.03mol/L PB(含1％蔗糖及1％BSA)，充分混匀后加入该条带上，于37℃烘干备用；

d)分析膜的制备

将硝酸纤维膜(NC膜)剪切成2.5×30.0cm规格的条带，用点样仪在NC膜上不同位置分别喷点AFP单抗和羊抗鼠IgG抗体，作为检测带和质控带，于37℃烘干备用；

e)免疫层析试纸条的组装

将吸水纸、NC膜、结合垫、样品垫依次贴在带有粘合剂的底板上，并切成4cm宽的试纸条即可。

4.根据权利要求3所述的基于上转换发光技术定量检测AFP的免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，对所述NaYF₄:Yb:Er纳米颗粒表面进行氨基化修饰的操作过程如下：

①进行表面硅化

将NaYF₄:Yb:Er纳米颗粒加入到含水10％～50％的乙醇溶剂中，配制成浓度为0.01～5mg/ml的悬浊液，在15～50℃水浴中搅拌均匀；向其中加入正硅酸乙酯(TEOS)，正硅酸乙酯与NaYF₄:Yb:Er纳米颗粒的质量比为(10～2)∶1，继续反应5～15小时，结束反应，离心洗涤备用；

②进行表面氨基化

将上述表面硅化的NaYF₄:Yb:Er纳米颗粒，加入甲醇与丙三醇按(0.2～2)∶1体积比组成的混合溶剂中，配制成浓度为0.01～5mg/ml的悬浊液，超声分散；向其中加入N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEAPS)，AEAPS与NaYF₄:Yb:Er纳米颗粒的质量比为(10～500)∶1，于15～50℃下恒温搅拌5～10小时，用乙醇离心洗涤，干燥即可。