[发明专利]一种CHO细胞中重组糖蛋白高水平表达的载体系统pGN

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明涉及一种CHO细胞中重组糖蛋白高水平表达的载体系统pGN。本发明还提供了特别适合在动物细胞中高效表达IFNβ的表达载体。

背景技术

目前已发展了多种蛋白质表达系统来生产生物体的外源蛋白，比如大肠埃希氏菌表达系统，酵母表达系统，高等真核细胞表达系统等，但这些系统仍存在某些有待改进的缺陷。如何应用这些新的表达系统来高效表达所需目的基因，也是本领域中急需摸索和研究的问题。

例如大肠杆菌作为宿主可表达多种蛋白，但是其存在(1)缺少真核生物的蛋白翻译后的修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等；(2)表达的蛋白多形成不溶性包涵体，需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性；(3)菌体蛋白较不利于纯化等缺点。

而酿酒酵母系统也具有局限性：(1)产量通常较低；(2)表达质粒易于丢失；(3)缺乏强有力的受严格调控的启动子；(4)外源蛋白过度糖基化修饰会严重的改变蛋白质的免疫原性、降低活性、缩短滞留时间；(5)分泌效率差，纯化困难。

综上所述，目前人类的糖基化蛋白质在动物细胞中表达存在表达量较低、生产成本高，或在细菌中表达时活性较低的技术难点。因此，本领域迫切需要开发一种在动物细胞中高效表达人类糖基化蛋白(尤其是IFNβ)的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种在动物细胞中高效表达人类糖基化蛋白(尤其是IFNβ)的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种可用于在动物细胞内表达外源蛋白的表达载体，其特征在于，所述的载体含有表达外源蛋白的表达盒，所述的表达盒从5’至3’依次具有以下元件：

(a)第一启动子，所述的第一启动子选自：CMV启动子；

(b)多克隆位点以及任选的位于多克隆位点之中、之前或之后的外源蛋白的编码序列；

(c)第一polyA序列，所述的第一polyA序列选自：牛生长因子polyA(bovine growth factor hormone polyA)；

(d)第二启动子，所述的第二启动子选自：β-肌动蛋白启动子、和SV40早期启动子、；

(e)选择标记基因，所述的选择标记基因选自：DHFR基因；和

(f)第二polyA信号序列，所述的第二polyA信号序列选自：SV40 polyA信号序列。

在另一优选例中，第二启动子是鸡的β-肌动蛋白(chicken β-actin)启动子。

在另一优选例中，所述的表达载体还含有增强子。

在另一优选例中，所示的表达载体在元件(a)和(b)之间还具有用于mRNA测序的T7启动子序列。

在另一优选例中，所述的增强子位于外源蛋白的编码序列的上游。

在另一优选例中，所述的外源蛋白的编码序列和所述选择标记基因含有起始密码子ATG和终止密码子。

在另一优选例中，所述的外源蛋白选自下组：促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子、垂体肽激素、绝经期促性腺激素、胰岛素样生长因子(如生长调节素-C)、角化细胞生长因子、神经胶质细胞系产生的神经营养因子、血栓调节蛋白、碱性纤维母细胞生长因子、胰岛素、因子VII、因子VIII、生长激素、骨形态形成蛋白-2、血小板产生的生长因子、水蛭素、及它们突变蛋白、片段、可溶性形式、功能性衍生物、融合蛋白。

在另一优选例中，所述的外源蛋白是β干扰素。

在另一优选例中，所述的β干扰素来源于人。

在另一优选例中，所述的β干扰素具有天然序列、变异序列或重组序列。更佳地，所述的β干扰素具有SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列

在另一优选例中，所述的抗性基因选自：腺苷脱氨酶(ADA)、新霉素(neo)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(tk)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)、多重耐药基因(MDR)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)和N-(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸抗性(CAD)、或嘌呤霉素-乙酰转移酶(PAC)

在另一优选例中，所述的标记基因是二氢叶酸还原酶基因(DHFR)。

在另一优选例中，所述的标记基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的载体还含有用于在大肠杆菌中扩增载体的复制起点(pUC)、以及用于在大肠杆菌中进行筛选的另一筛选基因。其中，所述的筛选基因、所述的标记基因和所述的编码外源蛋白的基因各不相同。