[发明专利]一种以重组蛋白为标签的表达纯化系统

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种蛋白表达纯化系统，尤其是一种以重组蛋白为标签的表达纯化系统，该表达纯化系统能够提高目的蛋白产率、实施监测蛋白表达效果、纯化过程。

背景技术

已知蛋白质的生产、分离和纯化在生命科学研究和多肽类药物生产中具有重要的地位。寻找使得蛋白质的产量提高、使得生产过程和纯化过程变的可视可控的良好方法，是本领域研究人员的研究重点之一。目前广泛应用的是成熟的原核表达系统所用的标签有麦芽糖结合蛋白标签(MBP)，谷胱甘肽转移酶(GST)标签、组氨酸His标签等，这些标签在提高蛋白的溶解度、帮助蛋白折叠方面显示了一定的作用。该表达纯化系统主要操作方法包括：设计重组蛋白的融合片段，构建带有目的片段的载体，转入大肠杆菌表达，粗分离，层析纯化和跑蛋白电泳验证。

但是，实践表明，目前的技术仍存在如下问题：对蛋白是否表达、表达量如何、是否形成包含体沉淀、是否存在断表达等情况并不能有一个直观的了解；同时在蛋白纯化时，对目的蛋白的走向一无所知，只能从峰值判断是否有蛋白流过；整个过程在暗箱中完成，需要花费大量的财力和物力去检验等等。因此现有技术的蛋白纯化体系中使用的标签尚无法实时指示目标蛋白在表达、纯化中的情况，蛋白纯化实验周期长，可控性弱。

发明内容

本发明的目的是为解决目前蛋白表达纯化中遇到的问题，提供一种以重组蛋白为标签的表达纯化系统。该表达纯化系统能够提高蛋白表达效率、实时跟踪蛋白表达纯化情况。

具体而言，本发明提供一种基于荧光蛋白的双标签“夹心法”蛋白表达纯化系统。

本发明采用新型荧光蛋白和His短肽为标签构建了一个双标签“夹心法”蛋白表达系统，其特征是将目的蛋白的两端接上标签，在N端连接一个新型蛋白sGFP标签，在C端连接上一个组氨酸His短肽，并在荧光蛋白标签两端和目的蛋白片段两端加有多核苷酸酶切位点，蛋白全长融合表达。本发明同时可以根据需要在目的蛋白与标签之间加入蛋白酶切位点，His标签可以根据纯化需要缩短或延长。

本发明中，将目的蛋白接上不同标签后进行融合表达表达，用亲和层析进行纯化，其中：荧光蛋白(superfold Green Fluorescence Protein，sGFP)为标签一，组氨酸His接头为标签二，构建成“夹心法”蛋白表达纯化系统。

本发明中，在目的蛋白N端接上荧光蛋白sGFP，在目的蛋白C端接上His6的短肽和一个终止密码子，重组蛋白进行全长融合表达，并用Ni柱亲和层析纯化。

本发明中，在目的蛋白与sGFP间，在目的蛋白与His短肽间具有多核苷酸序列酶切位点。

本发明中，在目的蛋白与sGFP间，在目的蛋白与His短肽间具有可插入的蛋白酶切位点。

本发明中，His短肽接头具有不同的氨基酸个数。

本发明所述的载体表达的融合蛋白N端是一个新型荧光蛋白sGFP，该荧光蛋白自身性质稳定，溶解度高，且能够帮助其C端的融合蛋白进行正确的折叠和表达，提高目的蛋白的可溶性，适合作为蛋白融合标签。同时，在可见光下sGFP激发绿光，因此在蛋白表达和纯化时能够对全过程可视化监控，仅通过肉眼监视蛋白的表达效率、断裂程度及纯化流程。

本发明中，提供了具有该双标签“夹心法”重组蛋白片段载体pT7His，其中，重组蛋白片段载体pT7His上有宿主体所识别的开放可读框orf，AMP抗性标记进行筛选，限制性内切酶位点BamHI，NdeI，XhoI，EcoI，SamI，HindIII，以及一段His短肽基因。

本发明中，采用限制性内切酶技术，其能够在特定的核苷酸序列处切开位点，帮助加入或去除所需要的片段。在荧光蛋白片段的两侧设计了多核苷酸酶切位点，能够帮助对荧光蛋白的替换。本发明将sGFP荧光蛋白的DNA序列加入到所述载体的左端，使其能够优先表达具有发光性能的荧光蛋白，使得整个表达纯化系统在第一时间达到可视化的效果。

本发明在目的片段两侧设计了多个核苷酸酶切位点，可以根据需要接入不同目的蛋白的片段，且便于对目的蛋白片段的替换，在商业生产上能够进行大规模的批量操作。

本发明中，所述的His标签放在了重组蛋白全长片段的末端，即C端，使得只有当该重组蛋白全长表达时，才能够具有His标签；而那些断表达的蛋白则不具有His标签，于是可以通过镍柱亲和层析得到分离，并在流出液中根据颜色判断重组蛋白断表达情况。

本发明中，可以根据需要缩短或延长Hi s短肽的氨基酸个数，从而优化分离纯化的效果。