[发明专利]降血糖药物疗效检测

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体降血糖药物疗效的试剂盒，通过检测降血糖药物用药靶向位点CYP2C9基因和CYP2C19基因多态性位点来评估个体降血糖药物疗效。

背景技术

糖尿病是一种与胰岛素产生和作用异常相关，以高血糖症为主要特征的代谢性疾病，包括以胰岛素绝对缺乏为主的1型糖尿病(T1DM)及以胰岛素相对缺乏和胰岛素抵抗为主的2型糖尿病(T2DM)两种类型。目前，糖尿病在世界范围内已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后严重危害人类健康的第三大慢性病。我国糖尿病人群的构成以2型糖尿病为主，占糖尿病人群的90％以上。

糖尿病治疗的目标是控制高血糖，纠正代谢紊乱，防止和延缓并发症。主要治疗手段为使用胰岛素治疗，口服降血糖药物治疗，以及胰腺移植和胰岛细胞移植。对于口服降血糖药物来说，其药效往往因人而异，受药物代谢酶影响较大。然而，随着人们对药代学、药效学和药物基因组学的深入了解和把握，使得通过更加灵敏、有效的基因检测手段来预测药物疗效和规避不良反应成为可能。

CYP450基因存在多态性，部分多态导致酶活性降低或失去活性，从而影响对药物的代谢水平。其中CYP2C9和CYP2C19基因编码的酶在部分口服降血糖药物的代谢过程中发挥着重要的作用。

迄今已在CYP2C9基因的编码区和非编码区发现了33种单核苷酸多态性(SNP)，依次被编为*2～*34号，*1定义为无突变的野生型。研究较多主要是CYP2C9*2～*6五种多态性，且其中最重要的是*2(Arg144Cys，又表示为C416T)和*3(Ile359Leu，又表示为A42614C)两种。上述突变的发生频率具种族差异。

CYP2C9底物的体内代谢与其基因型相关。在日本人和英国人中发现CYP2C9*3的杂合子病人所需华法林的平均剂量为*1野生型的60％，而*3纯合子病人的剂量仅为*1野生型的10％，即正常人的剂量为4～8mg/d，而CYP2C9*3纯合子仅需0.4mg/d。CYP2C9*2同样存在类似现象，杂合子和突变纯合子分别降低15～20％和40％。而且，携带CYP2C9*2和*3的病人应用华法林时发生出血并发症等不良反应和国际标准化比率(INR，一种抗凝作用指标)增高(＞4.0)的概率显著高于正常人。在土耳其人和日本人中发现*2和*3杂合子个体服用苯妥因后12小时血药浓度比正常人高30％，而有*3纯合子个体的苯妥因体内口服清除率降低79％。CYP2C9*3纯合子个体对甲苯磺丁脲和格列吡嗪的体内口服清除率较正常人低80％，或者其半衰期延长3～4倍。

虽然CYP2C9*2等位基因对酶活性的影响很大，仅小于*3，但是研究发现该等位基因在中国人中出现的频率非常低，几乎为零。因此，对于中国人来说，CYP2C9基因多态性对药物代谢的影响主要来自于*3等位基因。

对CYP2C19催化代谢的药物，在人群中可表现为2种代谢型，一种为强代谢型(extensive metabolizer，EM)，另一种为弱代谢型(poor metabolizer，PM)。多数人一般表现为强代谢，弱代谢则主要是由于2个等位基因的突变和(或)缺失引起的。PM发生率存在着明显种族差异，白种人和非洲黑人中PM发生率为2％～4％，东方人高达13％～23％。在一个大样本量的研究中，中国人CYP2C19的PM所占的比例为14％，也就是有1.8亿人为PM.

发明内容

基于降血糖药物用药靶向位点CYP2C9基因和CYP2C19基因多态性可用来评估个体降血糖药物疗效的基础上，本发明提供一种检测个体降血糖药物疗效的试剂盒。

该试剂盒包括：

检测降血糖药物用药靶向位点CYP2C9基因和CYP2C19基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对；

荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、反应缓冲液、去离子水等)。

本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。

本发明试剂盒的组分和含量包括：

10X荧光定量PCR反应缓冲液2μl，

25mM dNTP混合液0.2μl，

25mM MgCl2溶液1.2μl，

5units/μl Taq DNA聚合酶0.05μl，

20μM特异性引物对  每条引物各0.225μl，

10μM特异性荧光探针对  每条探针各0.25μl，