[发明专利]一种Exendin-4衍生物的重组制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有Exendin-4活性的Exendin-4衍生物及其制备和应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

1992年，Eng等从分布于美国亚利桑那州和墨西哥北部的希拉毒蜥(Heloderma suspectum)唾液中分离到一种由39个氨基酸组成的蛋白，与GLP-1有53％的同源性，后将其命名为Exendin-4。随后的研究表明，Exendin-4和GLP-1作用于同一受体，信号转导途径类似，在哺乳动物体内具有完全相同的生理功能。Exendin-4能刺激葡萄糖依赖的胰岛素分泌，即在血糖浓度高时刺激胰岛素分泌，低浓度和正常浓度时不刺激胰岛素分泌；同时还具有促进β细胞增殖与新生、抑制胰高血糖素分泌、减缓胃排空、抑制食物吸收等作用。2005年4月，化学合成的GLP-1类似物Exenatide经美国FDA批准上市，临床实验表明：Exenatide能有效控制二甲双胍与磺酰脲类疗效不理想的II型糖尿病，降低空腹及餐后血糖，降低糖化血红蛋白含量，减轻体重，对II型糖尿病有较好的疗效。

但是，由于Exenatide(酰胺化的Exendin-4)的半衰期较短(2~4小时)，需每日皮下注射两次，给患者带来极大痛苦。可见Exenatide在临床应用上还是存在较大的缺陷，因此迫切需要开发半衰期更长的、便于临床使用的Exendin-4衍生物。

国内外对Exendin-4的研究方向之一是通过对其结构进行改变，将得到的Exendin-4衍生物应用于糖尿病治疗，以达到延长药物在体内的药效时间的目的。美国Amylin公司采用一个或多个聚乙二醇(PEG)聚合物修饰Exendin-4赖氨酸上的ε-氨基，上述Exendin-4衍生物与天然Exendin-4相比，能够显著延长半衰期，此外还能降低免疫原性、抵抗蛋白酶水解、提高生物利用度、降低毒性并增加稳定性，但该方法的制备工艺较复杂，产物分离纯化困难，而且得率很低，不利于工业化生产。

Exendin-4衍生物可以通过固相化学合成制备获得，见本发明人的发明专利申请(申请号为“200910045187.6”，发明名称为“一种Exendin-4衍生物及其固相化学合成”)，但该制备方法的成本较高，因此，本发明提供了一种经济高效的，利用DNA重组技术制备Exendin-4衍生物的方法。

发明内容

本发明涉及的Exendin-4指Exendin-4(1-39)，其序列(Seq ID No.1)罗列如下：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser。此外，还涉及Exendin-4的截短形式Exendin-4(1-30)，其序列(Seq ID No.5)罗列如下：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly。

本发明提出的Exendin-4衍生物m39Exendin-4具有以下三种结构：Exendin-4(1-39)-Xaa40(Seq ID No.2)，Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41(Seq ID No.3)和Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Seq ID No.4)之一，其中Xaa40，Xaa41和Xaa42分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一个氨基酸。

本发明提出的Exendin-4衍生物m30Exendin-4具有以下三种结构：Exendin-4(1-30)-Xaa31(Seq ID No.6)，Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32(Seq ID No.7)和Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32-Xaa33(Seq ID No.8)之一，其中Xaa31，Xaa32和Xaa33分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一个氨基酸。

上述衍生物不仅保持了天然Exendin-4在体内的活性，还显著延长了体内药效时间，具有非常良好的临床应用价值。此外，该衍生物通过DNA重组技术制备，成本低，产量高，有利于大规模生产和使用。