[发明专利]一种多效价活疫苗、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖动物病害防治技术，具体地说，涉及一种多效价活疫苗、其制备方法及应用。

背景技术

目前，规模化、集约化、高密度养殖模式逐渐成为我国海水鱼类养殖业的发展主流。然而随着海水养殖业的不断稳步发展，各种病害问题日益突出，对养殖的产量及成长造成严重影响，例如，在我国，近几年发展起来的海水网箱养殖和工厂化养殖鱼类的突发性、暴发性疾病频繁发生，海水养殖平均死亡损失率在30％以上，病害问题已成为制约海水养殖业健康发展的重要因素。

疫苗具有针对性强、抗病周期长、可终身免疫、效果显著和防治主动的特点，因此，接种疫苗在现代水产养殖规范中正成为世界各国研究和开发的主要前沿和应用领域。

由于水产养殖业的产业特点，要求病害防治技术必须经济、应用实施方便。因此，适用于水产养殖业的疫苗产品的开发除高效价的技术要求外，免疫成本必须低廉，不能超出养殖业的承受能力。其中，减毒活菌疫苗因具有给药方便、免疫效价高、成本低廉、可开发广谱疫苗的新技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫苗研究和开发的热点和前沿领域。

近年来，随着对病原基因背景的深入了解以及重组DNA技术的不断发展，将编码某一特定病原体蛋白的外源基因插入无毒力病毒或细菌疫苗株的基因组的某一部位，使其高效表达，但不影响该疫苗株的正常生长与繁殖。用这种重组体作为活疫苗进行接种时，病毒或细菌能产生特定的外源蛋白，并诱发机体产生特异性免疫应答。目前，这种能针对多种病毒病害的多效价疫苗也已成为疫苗开发的国际前沿和热点领域。其中，利用高效信号肽分泌表达外源病原蛋白已成为多效价疫苗开发中的一种重要技术手段，并且该技术已在大肠杆菌及沙门氏菌的疫苗开发中得到了成功应用(Gentschev I，et al.The E.coliα-hemolysin secretion system and its use in vaccine development.Trends Microbiol，2002(10)：39-45及Russmann H，et al.Delivery of epitopes by the Salmonella type III secretion system forvaccine development.Science，1998(281)：565-568)，但在鳗弧菌疫苗的研制中还未见相关技术应用的报道。

弧菌是导致海水养殖鱼类细菌性疾病的一种最为常见的病原体，可导致鱼类弧菌病(Vibriosis)，其发生温度范围大，季节长，地域广，危害的种类多，有鲈科、鲻科以及鲆、鲽类等大多数海水鱼类，其中，鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等严重危害我国水产养殖鱼类中牙鲆、大菱鲆、真鲷和鲈鱼等名贵经济鱼种。同时，这些病原菌普遍存在于淡水、污水、淤泥和土壤中，对水产动物、畜禽和人类均有致病性，可引起多种水产动物的出血性败血症和人类腹泻，给养殖业造成巨大经济损失，也给人类健康带来威胁。

由于养殖鱼类多同时遭受多种弧菌病原体的侵害，所以，弧菌病疫苗多以几种弧菌病病原体的灭活联苗产品居多。但尚未见以鳗弧菌和嗜水气单胞菌为主要防治对象的商品化的多效价弧菌病活菌疫苗。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种重组质粒。

本发明还有一个目的在于，提供该重组质粒的制备方法。

本发明还有一个目的在于，提供一种多效价活疫苗。

本发明还有一个目的在于，提供该多效价活疫苗的制备方法。

本发明还有一个目的在于，提供该多效价活疫苗的应用。

本发明提供的重组质粒包含鳗弧菌金属蛋白酶的信号肽和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油脱氢酶的融合基因序列，其中，鳗弧菌金属蛋白酶信号肽介导3-磷酸甘油脱氢酶的分泌。

本发明提供的重组质粒的制备方法包括：A)构建信号肽-3-磷酸甘油脱氢酶融合基因；B)酶切融合基因和载体；C)将酶切的融合基因和酶切的载体进行连接。

本发明提供的多效价活疫苗由本发明提供的重组质粒转化鳗弧菌减毒株获得。

本发明提供的多效价活疫苗的制备方法包括：A)构建包含鳗弧菌金属蛋白酶的信号肽和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油脱氢酶的融合基因的重组质粒；B)将步骤A)获得的重组质粒转化鳗弧菌减毒株。

本发明提供的多效价活疫苗的应用为用于预防鳗弧菌和嗜水气单胞菌导致的鱼类疾病。