[发明专利]一种通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法

权利要求书

1.一种通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法，包括：

(1)第一步反应酶催化反应体系的构建

空白样品的准备：量取0.3mL200mmol/L醋酸缓冲液，0.1mL草酸及0.1mL失活 的草酸脱羧酶，混合备用；

待测样品的准备：量取0.3mL 200mmol/L醋酸缓冲液，0.1mL草酸及0.1mL酶活 ＞0.8U/mL的草酸脱羧酶，混合备用；

第一步反应酶催化反应体系总体积V₂为0.5mL，反应pH为3.0-5.5，反应温度为20-37 ℃，反应时间为30-60min；

(2)第二反应体系

分别准备2管各1mL的CO₂测定试剂，于37℃温育5min，pH 7.3～8.5，380nm条 件下测得A₁；

其中CO₂测定试剂的组成：8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mM NADH、1000-1200 U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和大于200-300U/L的苹果酸脱氢酶，66-100mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.3～8.5；

(3)第三反应体系

空白样品组：混合1mL CO₂测定试剂和0.01～0.05ml第一步反应酶催化反应空白样 品液V₃；

待测样品组：混合1mL CO₂测定试剂和0.01～0.05ml第一步反应酶催化反应待测样 品液V₃；

第三反应体系总体积V₁为1mL+V₃，37℃，5min，pH 7.3～8.5，380nm条件下测得 空白组A₂及待测组A₃；

(4)计算草酸浓度mmol/L

公式1

其中，V₁——最后的反应液总体积mL

v——加入待测样草酸体积mL

V₂——第一步酶反应液总体积mL

V₃——第三步参加酶反应液的体积mL

d——比色皿光径cm

ε₁——NADH的吸收系数：1.33L·mmol^-1·cm^-1，在380nm处 ΔA_380nm＝ΔA_待测-ΔA_空白；ΔA_空白＝A₂-A₁，ΔA_待测＝A₃-A₁。