[发明专利]一种RUNX3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种RUNX3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【背景技术】

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位。中国的胃癌发病率以西北最高东北及内蒙古次之华东及沿海又次之中南及西南最低每年约有17万人死于胃癌，几乎接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4，且每年还有2万以上新的胃癌病人产生出来，胃癌确实是一种严重威胁人民身体健康的疾病。

RUNX3是抑癌基因，序列号NM-0010316804340bp mRNAcds：440…..1729bp，在染色体1p36″位点上。RUNX3基因的表达降低或缺失是造成胃肠道癌的元凶，同时RUNX3基因的表达降低与肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌等发病密切相关。有人通过筛查肝细胞癌(HCC)RUNX3遗传学和表遗传学异常，拟明确RUNX3基因在HCC发病过程中的作用。采用聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性、杂合缺失(LOH)分析、测序以及DNA甲基化特异化的PCR技术对90例HCC RUNC3基因突变、LOH及甲基化状念进行检测，对RUNX3基因缺失、甲基化结果与各临床病理参数的关系进行分析。结果未发现突变病例；但发现3个单核苷酸多念性分别存在于外显子1和4；LOH分析表明30.6％(11/36)的病例存在LOH；54.4％(49/90)的病例存在RUNX3基因高甲基化；RUNX3LOH与HCC门静脉癌栓、肝内转移和微血管受侵差异有显著性(x2值分别为4.729、4.581、4.581，P值均＜0.05)。结论HCC RUNX3基因存在高频率的LOH和高甲基化；RUNX3基因的异常可能存在HCC发病过程中起重要作用。同样研究人员为探讨Runx3抑癌基因与胃癌的发生发展的关系及其在胃癌中沉默机制，该基因表达降低或缺失是其基因沉默的主要机制，为胃癌等恶性肿瘤的诊疗提供新的策略和方案。Runx3基因是一个肿瘤抑制基因，其功能缺失与多种恶性肿瘤的发生发展有关。自2002年日本学者Li等首先报道Runx3有调节胃上皮细胞的增生与凋亡平衡的作用以来，Runx3与胃癌发生、发展的相关研究已成为胃癌研究领域的热点。Runx3来自Runt结构域转录因子，是转录因子Runx家族成员之一，Runt区域转录因子也称PEBP2/CBF，是TGF-β超家族信号重要的靶目标，在哺乳动物生长过程中扮演重要角色。该基因家族在哺乳动物有3个成员Runx1、Runx2、Runx3，它们的产物都是由α和β亚单位构成的异二聚体，具有不同生物学功能，Runx1与造血功能有关，Runx2是重要的骨生成调节因子，Runx3对脊神经节的神经发育及胃黏膜上皮细胞的增生调控和T细胞的分化起重要作用。Runx3基因位于人染色体的1p36″.1，基因全长约67kb，含有P1和P2两个启动子，6个外显子和1290bp的开放阅读框，内含子1跨越了整条基因全长的一半。两个启动子区域均含数个分离的转录起始点，其中Runx3 mRNA主要来自于P2启动子的转录。两个启动子的GC含量不同，P2启动子GC含量高。在外显子2相当于启动子P2的位置和外显子6的起始部位有两个大CpG岛。人类Runx3蛋白是α、β两个亚单位构成的异二聚体，包含415个氨基酸残基，α亚单位含有一个RD保守域，RD位于Runx蛋白的氨基酸末端，由128个氨基酸组成，介导Runx蛋白与DNA结合以及蛋白质之间的相互作用。α亚单位介导RD与靶DNA结合，β亚单能增强RD与靶DNA的结合力。Runx蛋白的羧基端富含脯氨酸和丝氨酸，对基因的转录调控起重要作用。有人研究发现敲除Runx3的小鼠胃黏膜明显增厚，Runx3-/-小鼠培养细胞对TGF-β诱导的生长抑制和凋亡作用不敏感，且Runx3-/-小鼠胃组织中半胱天冬酶3无活性。Fukamachi等研究发现Runx3缺失时胃黏膜细胞处于低分化状态。这些观察表明Runx3是胃黏膜上皮主要生长调控因子，是胃上皮细胞中重要的致凋亡因素。癌中Runx3表达情况研究发现，胃癌中Runx3的表达明显下调或缺失。Li等应用RT-PCR、Southernblot和原位杂交方法对15株胃癌细胞系和46例胃癌组织标本的Runx3mRNA表达进行检测，结果发现47％的胃癌细胞系中Runx3零或低表达；60.9％的胃癌组织中Runx3零表达或低表达，Runx3的表达率与胃癌临床分期呈负相关。所以认为Runx3基因与胃癌的发生、发展有着极其密切的关系，并且随着胃癌分期的增高表达进一步降低。