[发明专利]一种用于识别乙型肝炎病毒耐药性的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于识别乙型肝炎病毒耐药性的检测方法，属于分子生物学技术领域。 

背景技术

全球至少有3.5亿人携带乙型肝炎病毒(HBV)，约有30％的感染者转化为慢性乙型肝炎，其中有3000万慢性乙肝患者在中国。乙型肝炎不仅可以导致肝硬化，而且是肝癌的原发病因，已经被WTO列为第9死因。 

核苷酸类药物已广泛应用于乙型肝炎患者的抗病毒治疗，包括拉米夫定(Lamivudine，LAM)，阿德福韦酯(Adefovir，ADV)，恩替卡韦(Entecavir，ETV)，替比夫定(Telbivudine，LdT)和泛昔洛韦(Famciclovir，FCV)等，这些药物主要作用于HBV DNA复制环节，通过抑制HBV逆转录酶活性，阻止病毒核酸的复制，降低HBV DNA载量，进而产生疗效。虽然这些药物对绝大多数病人来说初期使用效果都很明显，但随着治疗时间的加长，疗效会逐渐散失以致最后完全无效。统计表明，拉米夫定耐药的发生率第1年为15％，以后逐年增加，分别为42％、53％、70％；阿德福韦酯第1年未见耐药报道，第2～5年分别为3％、11％、18％、29％；恩替卡韦、替比夫定、泛昔洛韦也相继有耐药的报道，且同时服用多种核苷酸类药物可以导致多重耐药的发生。造成这种情况的主要原因是病毒在不停的变异，在逆转录酶基因上的一些特定变异会导致其表达产物逆转录酶躲避对应药物的抑制，从而使其变异病毒能够存活并繁殖。 

HBV是双链DNA分子，约3200个碱基组成，基因组由S、C、P、X四个开放阅读框组成，其中P基因区编码HBV DNA聚合酶，分为末端蛋白区、间隔区、逆转录酶区和RnaseH区四个区。其逆转录酶区长度为344个氨基酸，序列为349～692，即rt1～rt344，此区在HBV DNA的合成和逆转录过程中起重要作用，是病毒复制的关键部位，它又被分为A到E五个活性部位，A、C、D区为三磷酸核苷结合和催化位点，B、E区可能参与RNA模板和启动子定位。 

目前认为，HBV对核苷酸类药物耐药性的产生多与HBV P基因区变异有关，并且HBVP基因区变异是多位点的。拉米夫定耐药多由HBV逆转录酶C区YMDD基序中蛋氨酸(M)被异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)取代引起，常和B区一个额外的L180M变异相伴，即变异位点 为rtL180M+rtM204V、rtM204I，田德英等对服用拉米夫定治疗慢性乙肝的102例患者进行HBV YMDD变异检测，39例HBV DNA阳性耐药者中YMDD变异22例，变异率为56.4％，并与用药时间长短有关，9-17个月和18-30个月变异检出率分别为51.7％和70％，提示YMDD变异是HBV对拉米夫定耐药的原因之一。阿德福韦酯耐药与逆转录酶B区rtA181T和D区rtN236T变异有关，体外药敏试验表明，单一rtA181T、rtN236T变异可使HBV对阿德福韦酯敏感性分别下降4.3倍和7倍，而rtA181T+rtN236T联合变异可使药物敏感性下降18倍。刘峰等在51例接受阿德福韦酯治疗(10mg/d，疗程＞12月)发生病毒突破的慢性乙肝患者中，检出37例患者血清HBV存在rtA181T和/或rtN236T变异，耐药变异检出率高达72.55％。Colonno R等报道在拉米夫定耐药患者中有7％(13/189)在接受恩替卡韦治疗48周时在原有拉米夫定耐药基因变异的基础上出现恩替卡韦耐药基因变异，位点为B区rtT184A、C区rtS202I和E区rtM250V。替比夫定治疗引起的常见临床耐药位点为rtM204I，体外实验表明，替比夫定对单独的rtM204V变异株仍保持敏感，但对单独rtM204I变异和含有rtL180M+rtM204V的双重变异株均不敏感。泛昔洛韦治疗突破相关病例鉴定出变异的为B区rtV173L、rtL180M和C区rtV207E/I，体外评价FCV对野生株和变异株的抗病毒活性显示：rtV207E/I对FCV耐受性最高。 

乙型肝炎病毒在人体内由于受自然选择压力、人体免疫力和抗病毒药物治疗等因素的影响，常常出现变异。这些变异可能导致HBV出现免疫逃逸，致病性发生改变以及对药物产生耐药性，从而给临床诊断和治疗造成困难。HBV DNA聚合酶基因突变检测，会在对核苷酸类药物的选择及疾病预后的判断中发挥重要作用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种用于识别乙型肝炎病毒耐药性的检测方法，用于乙型肝炎患者核苷酸类药物的应用。 

为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种用于识别乙型肝炎病毒耐药性的检测方法，其特征在于，具体步骤为：