[发明专利]一种外切酶保护荧光定量PCR检测壬基酚的方法

权利要求书

1.一种外切酶保护荧光定量PCR检测壬基酚的方法，包括如下步骤：

(1)含受体细胞溶质的提取：取经过一个月壬基酚暴露喂养后的金鱼，用5mg/L的苯坐卡因麻醉。取出肝脏，用0.15mol/L冰上预冷的KCl溶液洗去肝脏外血液，再用灭过菌的滤纸吸干表面水分，按照肝脏m∶缓冲液v＝1∶4比例加入冰上预冷的HEDG缓冲液于玻璃匀浆器中匀浆；匀浆液于12000g离心20min，收集上清，再于16000g离心1小时，小心吸取上清，即为含有受体的细胞溶质，分装后于-80℃保存备用；

(2)结合DNA的制备：将pUC19质粒稀释50倍作为模板，常规PCR方法扩增制得结合DNA；产物于1％琼脂糖凝胶电泳分离，用PCR产物快速纯化试剂盒纯化回收；

(3)受体-配体结合：将1g/L的壬基酚按10倍比稀释为10^-8～10^-2g/L，各取10μl，加入上述提取的细胞溶质250μl，于20℃振荡温育2h；

(4)受体-配体-结合DNA复合物的制备：从上述每管中取出20μl于1.5mlEP管中，加入1μg poly(dI.dC)于20℃温育15min后，再加入2μl结合DNA，继续20℃温育15min，此时溶液中为受体配体DNA复合物；

(5)外切酶消解：按照复合物、核酸外切酶III buffer和HEDG缓冲液的体积比为6∶1∶3向复合物中加入核酸外切酶buffer和HEDG缓冲液，混匀后37℃温育15min；每20μl再加入核酸外切酶III 100U，混匀后于37℃温育15min；取出5μl酶切产物，加入S1核酸酶量为50U的15μl S1核酸酶混合液，37℃温育30min；再加入1μlS1核酸酶停止液，70℃灭活10min；得到荧光定量PCR的模板；

(6)荧光定量PCR扩增：每20μl体系的组成为SYBR Green I Master mix10μl，浓度为10μmol/L的引物R11μl，浓度为10μmol/L的引物R21μl，模板2.5μl，灭菌双蒸水5.5μl；荧光定量PCR循环步骤：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环40次；最后在72℃延伸5min；

(7)建立荧光定量PCR检测壬基酚标准曲线；

(8)根据标准曲线，经线性回归分析，得到壬基酚浓度与Ct值关系，进行不同浓度壬基酚的检测；

步骤(2)所述的结合DNA制备过程中，引物碱基序列为：上游引物F1：5′CGGAGTTCCG TGAGA AGA GG ATAAC GCAGG AAAGA ACATG 3′下游引物F2：5′CTCTTCTCAC GCAAC TCCGG TCAGG CAACT ATGGA TGAAC 3′；

步骤(6)所述的荧光定量PCR扩增过程中，引物碱基序列为：上游引物R1：5′TCGACGCTCAAGTCA GAG 3′；下游引物R2：5′TAGCA CCGCC TACAT ACC 3′。 

2.根据权利要求1所述的外切酶保护荧光定量PCR检测壬基酚的方法，其特征在于：步骤(3)所述的受体-配体结合，采用表面等离子体共振定性鉴定雌激素受体蛋白与壬基酚结合情况。

3.根据权利要求1所述的外切酶保护荧光定量PCR检测壬基酚的方法，其特征在于：步骤(5)所述的外切酶消解，S1核酸酶停止液含0.3mol/LTris碱，1.35mol/LEDTA。

4.根据权利要求1所述的外切酶保护荧光定量PCR检测壬基酚的方法，其特征在于：步骤(6)所述的荧光定量PCR扩增体系，每20μl体系中所包含MgCl₂浓度为2μmol/L。