[发明专利]哺乳动物细胞核受体转录活性的体外检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及哺乳动物细胞核受体转录活性的体外检测方法。

背景技术

核受体(nuclear receptor，NR)是哺乳动物细胞内一类配体依赖性转录因子超家族，是体内含量最丰富的几大类转录因子超家族之一。这个家族已知的成员已经达到200个左右，包括人们所熟悉的雄激素受体，雌激素受体，孕激素受体，糖皮质激素受体，甲状腺素受体，维生素D受体，全反式视黄醛受体，过氧化物倍增激活受体(PPARs)及许多目前尚不清楚配体的孤儿核受体等等。机体的生长发育，细胞分化，以及许多生理/代谢过程都可归因于核受体与其相应配体及众多共调节因子相互作用所调控基因网络协调表达的结果。核受体及其调控基因表达的紊乱几乎和所有人类重大疾病如肿瘤，糖尿病，高血压，心脏病等病理过程有密切关系。

通过对核受体家族成员cDNA序列以及所编码的氨基酸序列比较发现，它们是进化上相当保守的一类转录因子超家族。典型的核受体蛋白结构分A，B，C，D，E五个功能区。其中A/B区包含配体非依赖性的转录激活域AF-1；C区为高度保守的DNA结合结构域(DNA binding domain，DBD)，含两个锌指蛋白功能域；D是可变的铰链区；E区为配体结合域(ligand binding doma in，LBD)，介导配体结合和二聚体化过程，还包括配体依赖性转录激活域AF-2。在细胞浆中，当配体与相应核受体上的配体结合区结合，诱导受体蛋白与分子伴侣蛋白解离，并二聚体化，核受体被激活，移行进入核内，其蛋白链上的DNA结合结构域与基因组中特定的DNA序列结合，从而激活(打开)或抑制(关闭)下游基因的表达。

每种核受体在核内DNA链上都有自己特异识别的序列，如核受体中的甾体激素受体，它们激活后进入核内，与核内基因启动子和增强子上特异识别的DNA序列结合，这段特异序列又称激素反应元件(hormone response elements，HREs)，从而激活或阻遏靶基因的转录，起到调控代谢，发育和生殖功能等。由此可见，任何原因导致的核受体活性改变，都可能引发机体病理状态，测定核受体激活以后转录活性可为疾病诊断或分期、药物筛选等提供重要依据。

目前核受体转录活性的测定依赖于其对作用细胞增殖或代谢等功能的影响来检测。由于涉及细胞培养和一系列后续操作过程，所需时间长(一般至少要3天左右时间)，系统误差大，灵敏度和精确度都比较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为针对现有的核受体转录活性的测定方法所存在上述缺陷，急需一种新型核受体转录活性体外检测技术，以克服现有技术耗时长、系统误差大、灵敏度和精确度差等缺陷。

为此，本发明公开了一种哺乳动物细胞核受体转录活性的体外检测方法，其包含下列步骤：

a)配体或/和待测配体类物质和目标核受体进行温育，获得反应复合物；

b)反应复合物加入包含目标核受体特异识别DNA序列的报告基因表达载体的体外蛋白翻译系统或体外基因转录系统，进行报告基因RNA表达或报告基因蛋白表达；

c)检测报告基因mRNA或报告基因蛋白；

其中步骤a和b也可合并，在同一反应体系进行。

本发明原理是：将目的核受体特异识别的DNA序列重组接于表达质粒上报告基因翻译起始点的前面，将构建好的质粒与体外蛋白翻译系统混合，当配体和目标核受体温育时，若核受体与配体结合而被激活，由于核受体能特异结合其在质粒上的DNA识别序列，两者的结合，使已经具备转录因子功能的核受体启动下游报告基因的转录。转录出来的报告基因mRNA在蛋白翻译系统中立即被翻译成相应的报告蛋白。激活后的核受体转录能力越大，在相同的反应时间内被翻译出来的报告蛋白数量就越大，两者成正比关系。因此通过测定报告基因所表达蛋白的含量就可以反映核受体的转录能力大小。

在一些实施方式中，所述目标核受体可为通过基因工程表达的目标核受体蛋白或含有目标核受体的哺乳动物组织或细胞匀浆液。