[发明专利]改良裸鼠结肠癌原位移植瘤模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学科研用的一种新的结肠癌移植瘤模型，是在裸鼠结肠癌原位移植瘤模型的基础上改良而来。

背景技术

目前国内外肠道肿瘤的动物模型有：化学致癌物诱导法、肿瘤移植法和转基因动物模型。

化学致癌物诱导法造模周期长，成功率低，目前已较少使用。

转基因鼠成本高，品系少，在长期大规模试验中应用有一定困难。

肿瘤移植法是目前最常用的方法。其优点是：使一群动物同时接种同样量的瘤细胞，生长速率比较一致，个体差异较小，接种成活率近100％，对宿主的影响相类似，易于客观判断疗效，可在同种或同品系动物中连续移植，长期保留供试验用，试验周期一般均较短，试验条件易于控制等。肿瘤移植法又包括皮下移植瘤法、腹水瘤法、原位移植法等。原位移植因为可以提供给被移植物类似于人体的微环境，所以近年来得到广泛应用。目前裸鼠结肠癌原位移植瘤模型国内外均可见报道。但在我们的研究过程中，发现了该模型的一些缺点：瘤体生长过快，容易形成消化道的梗阻，导致试验动物死亡，试验周期内试验动物的死亡率过高(见图2)。

本发明在实验过程中巧妙地使用了一种新方法，将移植瘤块移植到结肠系膜内血管旁，成功地建立了改良裸鼠结肠癌原位移植瘤模型。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、能提供给被移植物类似于人体的微环境、不影响肿瘤的转移途经、不易导致消化道梗阻、宿主存活率高的的结肠癌移植瘤模型。

为了解决上述技术问题，本发明提供的结肠癌移植瘤模型的构建包括如下步骤：

(1)瘤源的制备

将结肠肿瘤细胞培养、传代后，用对数生长期的肿瘤细胞制备成单细胞悬液，调整细胞浓度至2×10⁷/ml；注射前用碘酊局部皮肤消毒，以0.1ml/只裸鼠，用无菌一次性注射器注入裸鼠右侧腋下皮下；注射完毕后裸鼠自然进食；待瘤体直径达1cm左右时，处死荷瘤鼠，消毒皮肤，切下瘤块，去除坏死部分，选用淡黄色或呈鱼肉状瘤组织置于生理盐水中，剪成直径2mm的瘤块备用；

(2)模型制作方法

造模裸鼠禁食4h，以0.5％戊巴比妥溶液35～50mg/kg体重腹腔注射麻醉；用碘酊消毒，取下腹正中或经右侧腹直肌切口约2cm，逐层切开腹壁各层，以血管钳牵开腹膜，辨认升结肠；在距回盲部2cm的升结肠系膜上沿结肠肠轴平行方向做一0.3～0.4cm切口，将已制备好的瘤块2块置于结肠系膜内血管附近，并用3-0丝线缝合肠系膜切口；常规缝合腹壁切口，麻醉清醒后自然进食；饮水中添加琥乙红霉素1g/100ml；将裸鼠饲养于无菌层流室中，室温控制在(25±1)℃，相对湿度40％～50％，连续观察3周。

本发明将制备好的瘤块移植于结肠系膜内血管附近，而非肠管的浆膜层。该方法建立了能重现人结肠癌自然临床病理过程，短期内不会发生消化道管腔梗阻，且转移模式与临床患者相似的动物模型，使模型动物造模后的生存时间明显延长。这对于抗肿瘤药物的研发、尤其对中医药抗肿瘤药物的筛选及作用机制的研究具有重要的现实意义。

本发明能实现类似于结肠癌原位移植瘤模型的目的，又能使在试验过程中因消化道管腔梗阻发生的宿主死亡率明显降低。本发明方法简单，造模成功率高，实用性强，具有一定的经济、实用价值。

附图说明

图1为本发明改良裸鼠结肠癌原位移植瘤模型的构建流程图。

图2是肿瘤结肠原位移植法构建的动物模型示意图(图中箭头所示为压迫肠道的移植瘤，可见肠道梗阻，梗阻近端肠管充气扩张)。

图3为本发明构建方法中移植瘤块种植部位示意图。

图3中：(1)瘤块种植部位；(2)结肠；(3)肠系膜前动静脉分支；(4)肠系膜前动脉；(5)盲肠。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

实施例1

1.材料和方法

1.1细胞株及试剂消化液(0.25％胰酶溶液+1mM EDTA)、含10％胎牛血清的RPMI1640+双抗培养液、PBS液、CO2培养箱、倒置显微镜、琥乙红霉素片

1.2动物BALB/C裸鼠20只，SPF级，购自中科院，鼠龄6～8周，体重18～20g。随机分为对照组10只、模型组10只。

2.动物模型的构建