[发明专利]一种乳酸菌细胞壁裂解物的制备方法和用途

说明书

发明领域

微生物学和免疫学领域。

发明背景

胃肠道微生物生态系统是人和动物体内最复杂和最大的微生态系统，胃肠菌群自身以及与机体之间始终处于一种动态的平衡中，肠道菌群的平衡和稳定对机体的生理功能具有重要的作用，对其宿主的健康具有深远的影响。

肠道内益生菌主要包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)、肠球菌(Enterococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)以及丁酸梭菌(Clostridium butyricum)^[2]。肠道益生菌可以通过非免疫调节作用来稳定微生态环境，即通过体内定植、黏附、竞争占位提高内源宿主的防御机制；除了这一方面外，益生菌可以通过提高机体的体液免疫水平和细胞免疫水平来增进机体的免疫防御机能。

目前，乳酸菌活菌制剂已在肠道疾病的防治、泌尿系统炎症防治等方面得到一定的临床应用(见《乳酸细菌——基础、技术和应用》P332-335、P343-343，张刚主编，化学工业出版社，2007年)。但尚未见到将粪肠球菌细胞壁分离并临床用于免疫调节方面的报道。

发明内容

1.菌种筛选：

粪肠球菌为人体肠道的正常菌群。新加坡国立大学研究发现，粪肠球菌是人体肠道乳酸菌中免疫调节性能最强的一类，而且其免疫调节机制与细胞壁组分有关。

本发明从健康婴儿肠道中分离出27种乳酸菌，通过实验发现只有4种粪肠球菌具有免疫调节的功能，表明了乳酸菌的免疫调节功能是依赖菌种的。从4种粪肠球菌中，又优选出高免疫活性的MB508菌。

2.粪肠球菌细胞壁裂解物制备方法：

将粪肠球菌培养液离心并洗涤菌体，再高温高压(121℃，0.1MPa，20min)灭活使菌体裂解，最后干燥，获得细胞壁裂解物质。

具体实施方式：

1.粪肠球菌分离：

取健康儿童新鲜粪便25g，放入装有95mL无菌水和玻璃珠的三角烧瓶中，充分振摇10min(250次/rain)，制成10^-1的稀释液.再稀释得到10^-2，10^-3，10^-4，10^-5的稀释液.

将各粪便稀释液分别取0.1mL涂布在肠球菌选择性培养基(Ec)平板上，37℃培养48h后，选取紫红色、表面光滑凸起、周边整齐、直径1.0～1.5mm的菌落，分别传于Ec基础斜面上.将各斜面菌种涂片、革兰染色、镜检，选取革兰染色阳性、圆形或卵圆形、单个、成对或短链状排列的菌株，定名为MB508菌。

2.MB508菌细胞壁裂解物制备：

将MB508菌培养液3000rpm离心5分钟，无菌水洗涤2～3次，高温高压(121℃，0.1MPa，20min)裂解灭活，最后喷雾干燥，得到粪肠球菌细胞壁裂解

3.用于改善接触性皮炎：

用四周龄BALB/c小鼠做试验，分成二组，一组喂以通常饲料为对照组。另一组为试验组，饲料中加MB508细胞壁物质(10mg/kg/天)，就诱导发性过敏反应的情况进行比较。在16周龄时二组都用50μL0.5％二硝基氟苯(DNFB)液处理以刺激诱导发生接触性皮炎，处理后5天用0.2％DNFB 20μL涂于耳壳使引起接触性过敏反应，在诱发过敏反应的24及48小时后用千分厚度计(Dial thickness gauge，卡尺)测量耳壳肿胀厚度。

喂给MB508的小鼠与对照组小鼠相比，耳壳肿胀可抑制一半，对耳壳组织做染色观察，表明喂食MB508的小鼠炎症细胞的浸润明显可受到抑制。

4.免疫调节：

18只小鼠随机分为2组，每组6只，分别为MB508组和生理盐水对照组，MB508组小鼠腹腔注射用无菌生理盐水配制的1mg/mL MB508细胞壁物质，生理盐水对照组注射生理盐水，2组每次均注射0.5mI每只，连续2d，注射后第4d进行小鼠巨噬细胞吞噬实验测定和血清溶菌酶活力的测定(按试剂盒说明测定)。

结果：

吞噬功能影响