[发明专利]一种新型的基因突变重组方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基因的体外分子进化的方法以及该方法在蛋白质(酶)编码基因的随机突变文库构建中的应用。

背景技术

基因突变技术是分子生物学研究中的常用策略，广泛应用于各种基因功能的改造和研究方面。基因突变技术不仅可以获得基因中特定序列与基因功能之间关系的信息，而且还可以通过对编码蛋白质(尤其是各种酶)的基因的突变对相应的蛋白质进行改造，通过这种策略可以研究蛋白质的功能或者对获得具有新的催化特性的突变蛋白质(酶)。在蛋白质工程领域中，常常需要对某种天然的酶进行改造从而获得各方面酶学性质得到提高的突变酶。蛋白质工程中的基因突变通常包括定点突变和随机突变两种策略，其中，定点突变的针对性强但需要对蛋白质结构与功能的信息有所了解，对于缺乏结构与功能的信息的蛋白质，这种策略往往不能凑效。基因突变另一种策略是蛋白质(酶)的体外定向进化(in vitro directed evolution)，它不需事先了解酶的结构和催化机制，而是通过模拟自然进化机制，人为地对编码蛋白质的基因进行随机突变，在获得大量突变体的基础上应用高通量的筛选策略定向筛选所需要的突变蛋白质(酶)。酶的定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究领域和应用范围，不仅可以应用于天然酶的改造以获得催化性能更优异的突变酶，同时也为研究蛋白质(酶)的结构与功能提供了新的途径。在过去的十多年中，定向进化技术已被广泛用于改善蛋白质(酶)的多种性质：如酶的稳定性与催化活性、底物特异性、酶的新功能、新型疫苗和药物分子的发现、抗体亲和力的提高等诸多方面。定向进化技术不仅在实验室用于科学研究，而且已有定向进化的酶制剂进入市场，显示了蛋白质定向进化技术在蛋白质工程中的巨大应用前景。

目前已经发展出一些方法与技术用于蛋白质的定向进化，并成功地应用于许多蛋白质(酶)的改造。定向进化的第一步，需要应用一定的方法构建一个随机突变库。目前主要的方法包括易错聚合酶链式反应(PCR)，由于其简便快速而成为其中最常用的方法，但通常只能引入单一核苷酸的突变。为了克服易错PCR的这个缺陷，DNA改组(DNA shuffling)技术应运而生，其核心就是利用DNase I随机切割一组高度同源的核苷酸序列，使之片段化，再通过PCR延伸，最后组装成一个完整的编码序列。在这个过程中就可以把不同DNA分子间的突变或差异重组形成一个新的突变基因。DNA shuffling已经成为目前定向进化研究的主要技术方法，已经成功地应用于多种蛋白质的改造，并取得了良好的效果。DNA shuffling技术通常需要两步过程，一是利用易错PCR获得突变序列；再利用DNase I将这些片段随机切割成小片段，通过无引物的PCR将小片段进行重新延伸组装获得一个突变基因库，DNAshuffling技术在引入突变多样性上十分高效，但在DNA shuffling中DNase I随机切割操作过程不容易控制，费时费力，必须设立平行实验。这也是它的不足所在。在DNA shuffling的基础上，又发展出一系列改进技术，如家族改组(family shuffling)，利用单链DNA(ssDNAs)为模板的DNA shuffling等。除了DNA shuffling外，近年来发展起来的随机引物体外重组法(random-priming in vitro recombination，RPR)、交错延伸(staggered extension process)等方法也应用于蛋白质(酶)的改造上，但应用的并不广泛，文献报道较少。

发明内容

本发明针对常规DNA shuffling方法的不足，提供了一种基于内切核酸酶(endo V)的新型的基因随机突变的方法并将其应用于脱毛蛋白酶随机突变文库的构建。