[发明专利]苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白基因cry1518-35及应用

说明书

技术领域

本发明属于农业生物防治和农业微生物基因工程领域。具体涉及一个具有杀线虫活性的杀虫晶体蛋白基因的分离、克隆以及它编码的蛋白在微生物杀虫剂中的应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一类广泛存在于土壤中的革兰氏阳性细菌，在其生长发育过程中，能够形成内生芽胞，因其伴随芽胞形成而产生对昆虫具有特异毒性的杀虫晶体蛋白(InsecticidalCrystal Proteins，ICPs)，而有别于分泌肠毒素的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)和引起炭疽病的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)。研究表明，苏云金芽胞杆菌产生的晶体蛋白可以对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲10个目500多种昆虫以及原生动物、线形动物门、扁形动物门中某些有害种类也有特异的生物活性(SchnepfH E，Crickmore N，Rie J V，Lereclus D，Baum J，Feitelson J，Zeigler D R，Dean D H.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev，62：775-806)。Aroian的实验室用实验充分证明了苏云金芽胞杆菌对线虫的特异活性(Wei*J.Z.，Hale*K.，Carta L.，Platzer E.，WongC.，Fang S.C.，and Aroian R.V.(2003).Bacillus thuringiensis Crystal proteins that target nematodes.Proc.Natl.Acad.Sci.100：2760-2765)。

苏云金芽胞杆菌野生菌株一般含有多个编码杀虫晶体蛋白的基因。自1981年Schnepf和Whiteley从库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)菌株HD-1中克隆得到第一个杀虫晶体蛋白基因以来，陆续发现并鉴定了许多新的杀虫晶体蛋白基因。此后，新的杀虫晶体蛋白基因的克隆一直是苏云金芽胞杆菌研究领域中的热点。因此在1995年的无脊椎病理学年会上成立了由Crickmore等学者组成的杀虫晶体蛋白基因命名委员会，并于1996年正式提出了苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白按氨基酸序列同源性进行分类的新的分类系统，规定了命名规则和分类原则。其规定：cry基因是来自苏云金芽胞杆菌编码伴胞晶体蛋白的杀虫基因或者与已知cry基因有明显的序列相似性的基因，cyt基因是编码具有溶细胞活性的伴胞晶体蛋白基因或与已知编码Cyt蛋白有明显的序列相似性的基因。根据全长基因推导的氨基酸序列的同源性分为四个等级。级与级之间的界限为同源性95％、78％和45％。截至2008年12月，苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因已累计达到55类436种cry基因和2类27个cyt基因(Crickmore N，Zeigler DR，Feitelson J，SchnepfE，van Rie J，Lereclus D，Baum J，Dean DH.1998.Revision ofthe nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidalcrystal proteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813)。

根结线虫(Meloidogyne)是一种重要的植物寄生线虫，主要寄生于被感染植物的块根、块茎、鳞茎或球茎上，从寄主体内吸取营养，造成寄主植物的生长发育不良、畸形、矮化甚至死亡，每年都给农业生产带来重大损失。它们可以寄生于110多种植物，包括大豆、花生、烟草、黄瓜、牡丹等，而茄科、葫芦科、十字花科等植物的受害尤其严重(刘维志，植物病原线虫学，北京：中国农业出版社，2000)。由于其生活史短，分布面广，目前已经成为农业生产上最重要的病原生物之一(Widmer T L，Abawi G S.Mechanism ofsuppression of Meloidogyne hapla and its damage by a green manure of Sudan grass.Plant Disease，2000，85(5)：562-568.)。同时又由于根结线虫的侵入往往会使真菌和细菌更易侵染植物，是诱发植物病害的重要原因之一(汪来发等.根结线虫生物防治研究进展.南京林业大学学报(自然科学版)，2002，26(1)：64-68.)。