[发明专利]牛精子克隆胚胎的方法

说明书

技术领域

本发明涉及哺乳动物繁殖技术领域，具体涉及一种利用牛精子克隆胚胎的新方法。

背景技术

自成功利用体细胞核移植技术获得成活的克隆羊[1]以来，多种哺乳动物甚至包括一些灵长类哺乳动物相继克隆成功。尽管动物克隆技术存在效率低的问题[2]，但却很好的证明了卵母细胞质和供体细胞核能够支持整个胚胎发育过程。并且体细胞核移植技术在再生医学、新药物开发、动物育种等方面具有革命性的应用前景，故现在动物克隆技术仍是国内外的研究热点。

然而，国内外有关动物生殖细胞克隆的研究相对较少。并且考虑到原生殖细胞处于基因组印记消除状态，现今生殖细胞克隆技术一般仅局限于利用动物胚胎期的原生殖细胞进行克隆。Kato等选用妊娠期14.5-16.5天的小鼠胎儿原生殖细胞作为供体进行核移植，重构胚发育至妊娠期9.5天[3]。随后，Lee等报道，利用妊娠期11.5-13.5天的原生殖细胞作为供体而生产的重构胚能发育至妊娠期11.5天[4]。在利用妊娠期10.5天的原生殖细胞进行克隆的尝试失败后[5]，Yamazaki等根据他们的研究结果推断原生殖细胞并不适合作为核移植的供体。但同样是用妊娠期10.5天的原生殖细胞作为供体进行核移植，Miki等却成功的获得具有生育能力的后代[6]，证明了原生殖细胞克隆是可以成功的。

目前，国内外尚无利用哺乳动物精子进行动物克隆的相关报道。理论上，精子克隆能够使得后代中的遗传物质几乎全部来自于父本或母本，而且利用性控精液进行动物克隆还能控制后代性别。这些是生殖细胞克隆技术的诱人之处，但同时也有可能是该技术将面临的挑战。Surani等[7]和McGrath等[8]的研究表明，由于基因组印记的存在使得父源和母源基因组对小鼠的胚胎发育都是必需的。而Hoppe和Illmensee却称成功的生产出遗传物质全部来自与父本或母本的单性生殖小鼠[9，10]。近来，Kono等也报道了孤雌生殖小鼠的诞生[11]，引起了世界性的关注。由此看来，精子克隆虽然在理论上可能存在挑战，但这都是能够克服的，况且小动物上的理论也不一定适用于大动物。

动物精子克隆技术的研究无论在科学机制探讨上，还是在技术推广应用上，都具有非常重大的意义和价值。首先，该技术是首次在哺乳动物去核的中期II卵母细胞中通过显微操作注射进两个精子。这两个精子能否发生去致密而形成两个雄原核，然后两个雄原核相互融合并激发重构胚卵裂？两套来自父本的基因组能否支持重构胚顺利通过胚胎发育的早期阻滞，并发育至分娩，产下具有生育能力的后代？其次，在家畜动物精子克隆胚发育的整个过程中，重构胚的印记状态具有什么样的变化规律？这些问题都有待解决。再次，在动物育种技术的推广方面，精子克隆比体细胞克隆具有更多优势。种公畜的精子比种公畜的体细胞系更容易获得、保存、运输。精子克隆技术还可以选用来自两个不同品系家畜的精子，从而加快家畜的品种改良。况且，性控精子克隆技术还能实现后代性别的控制。这些都是体细胞克隆所无法比拟的。最后，就像体细胞核移植技术成功用于转基因动物的生产一样[12-16]，精子克隆技术同样也能应用于生产转基因动物，甚至是转基因性控动物，从而为转基因动物生产开辟一条新道路。

发明内容

本发明的目的是利用牛的精子代替体细胞作为供体用于核移植，从而生产精子克隆胚利用牛卵细胞去核，利用精子在体外获能，通过核移植方法生产获得牛精子克隆胚胎。

本发明是这样实现的：

一种牛精子克隆胚胎的方法，其步骤包括：

(1)将采集回的牛卵巢用磷酸缓冲液洗后将卵丘-卵母细胞复合体抽出，置于成熟培养液中进行体外培养，使所述的卵母细胞培养发育至第二次减数分裂中期，用透明质酸酶对卵丘-卵母细胞复合体脱颗粒细胞处理；

(2)先对步骤(1)的卵母细胞的细胞核染色，置于卵母细胞去核液中，再对细胞核进行荧光定位，准确吸取所述的细胞核，得到去核的牛卵母细胞；

(3)采集同一头优秀种公牛的精液，或采集同一品种的不同个体的两头优秀种公牛的精液，或采集不同品种的两头优秀种公牛的精液，或购买性控优秀种公牛的商用精液，将所述的种公牛精液置液氮罐中贮存备用；

(4)将所述的种公牛精液在37℃下解冻，用精子获能液使所述的精子获能，置于卵母细胞注射液中备用；

(5)用显微操作针一次性将步骤(4)所述的两个获能精子注入去核牛卵母细胞的胞质内，得到精子重构胚；

(6)将步骤(5)构建好的精子重构胚用激活培养基-1和激活培养基-2进行体外人工激活，使重构胚融合，然后，将激活后的精子重构胚置于胚胎培养液中培养；