[发明专利]东北天南星凝集素蛋白编码序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种在东北天南星中表达的凝集素蛋白(东北天南星凝集素蛋白，Arisaema amuremse agglutinin，ArA-Lectin)及其核酸序列。本发明涉及该蛋白的氨基酸和核酸序列的制备方法和用途。 

技术背景 

植物凝集素是含有至少一个非催化结构域并能可逆结合特异单糖或寡糖的一类(糖)蛋白质(Peumans和Van Damme，1995)。它们最大的特点在于其能够识别糖和糖类，每一种凝集素具有与某一种特殊的碳水化合物专一结合的能力。另外它们还能选择性地使不同来源的血红细胞发生凝集，因而又命名为植物血凝素(phytohemagglutinin)。从1888年Herman Stillmark在蓖麻籽中发现第1个凝集素到现在，已发现了1000多种植物凝集素。由于分离的凝集素越来越多，人们为了便于研究，对它们进行了归类(高莹等，2000)。根据植物凝集素亚基的结构特征，植物凝集素被分成4种类型：部分凝集素、全凝集素、嵌合凝集素、超凝集素；根据氨基酸序列的同源性及其在进化上的关系，植物凝集素可以分为7个家族：豆科凝集素、几丁质结合凝集素、单子叶甘露糖结合凝集素、II型核糖体失活凝集素、木菠萝素家族、葫芦科韧皮部凝集素、苋科凝集素；根据凝集素专一识别的糖类的不同，可以分为6个组别：岩藻糖组、半乳糖/N-乙酰半乳糖胺组、N-乙酰葡萄糖胺组、甘露糖组、唾液酸组、复合糖组。 

植物凝集素在植物界的分布极其广泛，不仅对蚜虫、叶蝉和稻飞虱等同翅目的害虫有很高抗性效果，同时对鳞翅目、鞘翅目的害虫也有一定的效果，并对一些真菌病害有效。众所周知，同翅目的害虫不仅寄主范围广，除因取食使植物营养不良导致减产外，更严重的是，其取食过程可导致植物感染100多种病害，使作物大幅减产。由于凝集素的这一独特抗虫特性，因此凝集素基因在抗虫转基因分子育种中具有独特的优势和广阔的应用前景(潘科等，2002；赵强等，2005)。 

1982年Hoffman克隆了第一个凝集素基因，它编码一个菜豆凝集素蛋白。现在已有很多凝集素基因被克隆，如p-lectin、WGA、GNA、PTL等。2000年数据库(EMBL)检索表明人们已克隆了222个植物凝集素基因，它们大多编码豆科凝集素和单子叶植物甘露糖结合凝集素。目前成功地用于植物抗病虫害基因工程的植物凝集素基因主要有：雪花莲凝集素基因、豌豆外源凝集素基因、麦胚凝集素基因、苋菜凝集素基因及核糖体失活蛋白基因等。在植物中表达凝集素要求相对高的水平才具有较好的抗虫效果，构建强的高效表达载体，采用合适的强启动子，针对害虫取食是韧皮部可采用特异性表达启动子，或与其它的杀虫蛋白相结合提高抗性。具有抗蚜活性的基因应用最多的是雪花莲外源凝集素(GNA)基因。目前报道的转植物凝集素基因的植物有水稻、烟草、马铃薯、小麦、番茄等，均表现出对桃蚜、水稻褐飞虱、菜园夜蛾和麦长管蚜等害虫的抑制和抗性。 

本发明中，我们在天南星科(Araceae)植物东北天南星(Arisaema amuremse)中克隆到半夏凝集素(PTA)基因的同源基因东北天南星ArA-Lectin基因。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的东北天南星凝集素ArA-Lectin蛋白的序列及其核酸序列。 

发明内容 

本发明的第一个目的就是提供一种新的基因，即东北天南星凝集素基因(araa)，该基因是一个编码东北天南星凝集素(ArA-Lectin)蛋白的基因。 

本发明的第二个目的是提供一种新的凝集素蛋白，该蛋白是东北天南星Ara-Lectin。 

本发明的第三个目的是提供一种利用重组技术生产上述新的东北天南星Ara-Lectin蛋白和核酸序列的方法。 

本发明还提供了东北天南星凝集素Ara-Lectin蛋白多肽和编码序列在防治农业害虫上的应用。 

在本发明的一个方面，本发明提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有东北天南星ArA-Lectin蛋白活性的多肽核苷酸序列，所述的核苷酸序列与序列表SEQ ID NO：1所示。该序列的开放读码框部分(Open Reading Frame，ORF)包括780个碱基，编码259个氨基酸。在发明的另一方面，本发明提供了一种分离出的东北天南星ArA-Lectin蛋白质多肽，它包括：具有SEQ ID NO.1氨基酸序列的多肽。 

在发明的另一方面，还提供了一种制备具有东北天南星ArA-Lectin蛋白活性多肽的方法，其步骤如下：