[发明专利]魔芋中芋花叶病毒分子快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病虫害检疫领域，更具体涉及一种魔芋中芋花叶病毒(DsMV)分子快速检测方法，利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分子生物学技术对魔芋中DsMV进行快速检测。

背景技术

魔芋(Amorphophallus)属天南星科魔芋属多年生草本植物，也是我国贫困山区重要经济作物之一。我国主要分布于湖北、云南、四川等长江流域。因魔芋地下球茎中含有葡甘露聚糖，目前广泛用于食品、纺织印染、石油钻探、制药、日用化工等领域，有很好的经济效益。但因常年无性繁殖，使病毒积累，种性退化，丰产性和品质无法保证。芋花叶病毒(dasheen mosaic virus，DsMV)是确定在天南星科植物上发生最普遍和危害最严重的病毒病原。Zettler等(1987)指出芋花叶病毒(DsMV)使天南星科Caladium、Dieffenbachia、Philodendron和Zant2edeschia等属作物减产约60％。虽然相继有多位学者对天南星科植物病毒病害进行了探索性研究，但由于该科植物本身材料的特点使研究相对难以深入。到目前为止，天南星科植物上鉴定和分离的病毒相对较少，而且该科植物侵染的病毒研究方法还局限于传统生物学方法。近年来发展的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法因其具有灵敏、快速、特异性强等优点，在植物病毒的检测上显示出强大的优势。自1990年起，国内外已相继用RT-PCR方法检测了多种病毒，如：马铃薯Y病毒(PVY)，马铃薯卷叶病毒(PLRV)，马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)等，但至今国内外至今未见有关魔芋中芋花叶病毒的报道。本发明通过合成一对扩增DsMV特异性外壳蛋白(cp)基因中间部分核心序列的寡核苷酸引物，利用RT-PCR技术建立了一种经济简便检测魔芋中芋花叶病毒的方法。此方法将对魔芋脱毒苗的检测和DsMV的控制起到重要作用。

发明内容

本发明目的是在于提供一种魔芋中芋花叶病毒分子快速检测方法。该方法操作方便，经济快速，且可100％检测魔芋是否带DsMV，从而为魔芋中DsMV的防治、脱毒苗的检测提供有效手段。

为达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

根据已报道的DsMV一对特异性外壳蛋白(cp)基因序列，首先合成1对扩增DsMV的cp基因中间部分核心序列的寡核苷酸引物；然后将提取的魔芋叶片的总RNA反转成complement DNA，再以complement DNA为模板，结果扩增得到了与预期大小一致的0.35kb片段，接种DsMV后感病的魔芋也扩增到了此片段，而对照(清水和健康魔芋)中未扩增到任何产物。

一种魔芋中芋花叶病毒分子快速检测方法，其步骤是：

A、依据陈集双主编的《天南星科植物病毒的分子诊断和半夏研究》合成DsMV检测的特异性引物DF：5′-GGG CTT GGG TGA TGA TGG A-3′，DR：5′-GCC TTTCAG TGT TCT CGC TTG-3′，目的片段长度0.35kb；

B、用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取带芋花叶病毒的魔芋(dasheen mosaic virus，DsMV)叶片总RNA；

C、取一微量离心管，加入提取的RNA 8μL，10μM的oligo-d(T)4μL，72℃下变性5min，取出置于冰上放置5min，再依次加入：反转录酶缓冲液8μL，10mMol的三磷酸碱基脱氧核苷酸4μL，40U/μL的RNA酶抑制剂1μL，20U/μL的反转录酶2μL，加入0.1％(V/V)焦碳酸二乙酯处理过的重蒸水15μL，将反应混合物于42℃PCR仪中延伸1h，-20℃保存备用

D、在12.5μLPCR反应体系中，取上述反转录产物complement DNA 2μL，加10μM的引物DF和DR各1μL，10mMol的三磷酸碱基脱氧核苷酸0.8μL，反转录酶缓冲液2μL，20mMol的氯化镁0.7μL，2u/μl的Taq酶0.5μL，重蒸水4.5μL；反应条件是94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后再72℃延伸5min，在PCR仪上扩增，取扩增产物2.5μL进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统检测到0.35kb片段长度条带的为带病毒植株，无条带的为健康植株。