[发明专利]一种快速检测三聚氰胺(Melamine)含量的ELISA试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全检测，特别是涉及小分子的抗原、抗体制备及其检测方法的建立。本发明具体涉及通过阻断ELISA检测样品中三聚氰胺含量的方法及基于该方法的ELISA试剂盒的制备。

背景技术

小分子化合物，在组织化学上被称为半抗原，仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞的免疫反应性，而无免疫原性。对于半抗原的检测一般采用气相色谱、高压液相色谱、质谱等手段，但是免疫学检测方法在半抗原的检测上逐渐显示出其不可替代的优势。免疫学检测法不像传统的色谱和质谱等方法那样需要复杂、昂贵的设备，此外还具有易操作，前处理过程简单，成本低，检测快速、准确、灵敏，可实现高通量、自动化检测等优点，因此具有极为广泛的应用前景。

由于小分子化合物不具有免疫原性，所以小分子化合物的免疫学检测方法中至关重要的一步就是如何设计合成同时具有免疫原性和反应原性的小分子载体偶联物。通常将小分子化合物与分子量比较大的载体蛋白偶联制备完全抗原(免疫原)，借助载体蛋白的T细胞表位获得免疫原性，以刺激机体产生抗体。制备完全抗原时常用的载体有牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、兔血清白蛋白(RSA)、鸡卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、多聚赖氨酸(PLL)等。

本发明中的三聚氰胺(Melamine)(化学式：C₃H₆N₆)，俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为[1，3，5-三嗪-2，4，6-三氨基]，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水(3.1g/L常温)，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。

食品工业中常常需要测定食品的蛋白质含量，由于直接测量蛋白质技术上比较复杂，所以常用一种叫做凯氏定氮法的方法，通过测定氮原子的含量来间接推算食品中蛋白质的含量。由于三聚氰胺(含氮量66％)与蛋白质(平均含氮量16％)相比含有更高比例的氮原子，所以被一些造假者利用，添加在食品中以造成食品蛋白质含量较高的假象，从而造成诸如2007年美国宠物食品污染事件和2008年中国毒奶粉事件等严重的食物安全事故。

中国国家食品质量监督检测中心在2008年9月13日指出，三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，故暂未设定像农药般的残留标准限制。10月8日，卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理值：婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。液态奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。含乳15％以上的其它食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。有鉴于此，三聚氰胺含量检测成为目前国内食品安全检测的焦点。

三聚氰胺属于小分子化合物，与其他很多小分子化合物一样，一般采用GC、MS、LC-UV法、高效液相色谱法等测定三聚氰胺含量，相关检测机构建立的方法也少有报道。农业部标准NY/T 1372-2007中建立的饲料中三聚氰胺的测定方法是HPLC法和GC-MS法。最近国家质检总局与国家标准化管理委员会联合发布的《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》(GB/T 22388-2008)中也是采用HPLC法、LC-MS/MS法、GC-MS和GC-MS/MS法。但以上方法存在过程冗长、需要衍生、试剂用量较大及灵敏度低等缺点。

目前三聚氰胺免疫学检测方法也有报道，但是市面上能够有效检测三聚氰胺的试剂盒不多。本专利根据三聚氰胺小分子化合物的特点，设计抗原，制备特异性抗体，研制出的检测三聚氰胺的阻断酶联免疫(ELISA)试剂盒，能快速、特异性的检测出样品中的三聚氰胺，根据试剂盒内说明书操作能计算出三聚氰胺的含量；是一种高效、快速、经济的高科技产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种小分子抗原及抗体制备方法，利用酶联免疫吸附原理，建立一种能快速、特异性检测出样品中小分子物质(三聚氰胺)含量的ELISA方法。

所述小分子抗原制备方法指：将无免疫原性或弱免疫原性小分子(三聚氰胺)偶联到特殊载体上，使其同时具有免疫原性和反应原性。