[发明专利]奶牛产奶量相关基因牛ERα作为分子标记的应用

说明书

技术领域

发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种与奶牛产奶性状相关的基因ERα作为奶牛分子标记的应用。

背景技术

我国牛奶和牛肉的生产同发达国家相比差距较大，主要是因为我国奶牛品种和遗传品质比较差。应用分子标记的现代育种技术对于提高奶牛的产奶量和改善乳品质是先进有效的方法。将灵敏度极高的一些DNA分析手段应用于奶牛育种中，其主要目的是在DNA分子水平上寻找与奶牛产奶性状密切相关的遗传标记，用于奶牛的标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)，实现早期选择，加快育种速度。

乳腺发育主要受类固醇和多肽类等激素的调控。雌激素是乳腺细胞进行有丝分裂的有效分裂原，对于乳腺的正常发育是必需的(Jose Russo等，2002)。雌激素对靶细胞作用的分子基础是靶细胞内存在一种能与其特异性结合的雌激素受体(Estrogen receptor，ER)(Stumpf等，1977)。

雌激素受体(ER)是一类由配基激活的转录因子，介导大部分已知的雌激素效应。ER属于核受体超家族的成员，是一种能与雌激素特异性结合的糖蛋白，具有特异性强、亲和力高和结合容量低的特性，包括ERα(George et al.，1996)和ERβ(Eva Enmark等，1997)。ER分布于许多组织，包括中枢神经系统、心血管系统、免疫系统、泌尿生殖道、胃肠道、骨组织、肾脏、肺脏和子宫等。多数学者认为，雌激素对乳腺的作用由ERα介导。从初情期开始，乳腺细胞快速生长发育，这主要由雌激素刺激导管增生和孕酮促进腺泡发育引起的。Saji等(2000)用免疫组化法对大鼠乳腺中ERα和ERβ的表达水平进行了研究，结果发现初情期前乳腺中表达ERα的细胞约占40％，共同表达2种受体的细胞约占25％；妊娠期，多数细胞表达ERβ，少数细胞表达ERα，共同表达2种受体的细胞极少；泌乳期，主要是共同表达2种受体的细胞；断奶后，表达ERα的细胞较少，共同表达2种受体的细胞极少。虽然现已明确雌激素能促进乳腺导管的发育，但其受体在乳腺发育中的作用还不清楚。

王月影等(2007)对不同发育期大鼠乳腺组织中雌激素受体α的表达进行了研究，研究结果发现，妊娠期和泌乳期大鼠乳腺中ERα表达水平均低于处女期，且差异显著(P＜0.05)；整个妊娠过程中，以妊娠12d最高；泌乳期随着时间的延长，ERα的表达水平增加，但差异不显著(P＞0.05)。提示ERα可能参与了乳腺细胞的发育和凋亡。

迄今为止尚未见到有关牛ERα基因作为奶牛产奶性状的分子标记。

发明内容

本发明的目的具体涉及一种与奶牛产奶性状相关的基因ERα作为奶牛分子标记的应用。

本发明是这样实现的：

申请人通过制备获得了一个奶牛产奶量相关基因ERα作为分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示，其中在序列表SEQ ID NO：1的第114bp处有1个T114-A114的碱基突变，导致DraI-RFLP多态性。

其中用于扩增所述基因ERα和检测序列表SEQ ID NO：1的第114bp处T-A碱基突变的正、反向引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：5’CAGGGCTCTCTGGTTCTTTG 3’，

反向引物：5’GGAGAAGGAGCGTCTTTGTG 3’。

本发明的具体步骤如下：

(1)从被检牛血液样本中提取牛血液总DNA；

(2)根据报道的牛ERα基因序列(GenBank登录号：AY160683)，利用生物学引物设计软件Primer5.0和在线引物设计Primer3.0，综合考虑引物设计的各项原则，设计引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。所述引物对的核苷酸序列如下：

正向引物：5’CAGGGCTCTCTGGTTCTTTG 3’，

反向引物：5’GGAGAAGGAGCGTCTTTGTG 3’。

(3)PCR反应扩增程序为：94℃变性3min，35次循环(94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min)，72℃延伸10min，得到PCR扩增产物。

(4)用2.5％琼脂糖凝胶电泳对步骤(3)的扩增产物进行检测，所述电泳条件为电压100V，时间为20min，染色，在凝胶成像系统中观察条带。

(5)PCR产物回收测序，发现在114位存在突变位点。

(5)取16μL PCR扩增产物，加入5Dra I限制性内切酶和2μL 10×酶切缓冲液，加水至20μL，37℃，反应5h。