[发明专利]含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体，同时还涉及含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体的制备方法，还涉及含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体在快速且高通量检测三丁基锡中的应用。

技术背景

热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是生物适应环境温度或应激变化的一个重要媒介分子，过高或过低的温度都会诱导细胞或机体产生应激反应，迅速合成HSP作为分子伴侣参与蛋白质的合成、折叠、装配、运转和降解等过程，以维持细胞蛋白自稳，提高细胞对应激源的耐受性，增强抗氧化作用，使细胞维持正常的生理功能。热休克蛋白70(Hsp70)是HSP家族的主要一员，它是细胞在应激条件下的主要表达产物，用HSP70启动子作为调控外源基因表达的启动子，有利于启动外源基因的表达，并可通过应激对外源基因的转录进行调控(Bukau B，Horwich AL.The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.Cell.1998.92(3)：351-366；JG，Kristensen TN，Loeschcke V.The evolutionary and ecological role ofheat shock proteins.Ecol Lett.2003，6(11)：1025-1037；陈全，朱道银，骆旭东，蒋英，江山。用结核分枝杆菌HSP70启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒的研究。重庆医科大学学报。2003，28(6)：697-700；冯立芳，缪炜。不同纬度螅状独缩虫耐热能力及Hsp70 mRNA表达水平的比较。动物学报。2008，54(3)：525-530。)。

绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein，GFP)是从水母中分离出来的一种发光蛋白，以它作为标记蛋白具有诸多优点：检测方便，用荧光显微镜或激发光源即可观察；荧光稳定，无光漂白现象，能耐受长时间的光照，在很大pH值范围内(7～12)均正常发光；灵敏度高；对受体细胞基本无毒害；不受假阳性干扰，四膜虫本身不含有GFP，故不会出现假阳性结果；不需任何反应底物和辅助因子参与；可制成永久标本；分子量小，与其它基因的融合表达载体在真核细胞中所表达的融合蛋白具有目的基因和绿色荧光蛋白的双重活性，从GFP的荧光强度即能准确反映基因的表达水平，同时还能对目的基因进行亚细胞定位分析(Tsien RY.The green fluorescent protein.Annu Rev Biochem.1 998，67：509-544；王晓丽，邵卫星，单虎。绿色荧光蛋白研究进展。动物医学进展。2008，29(1)：56-59。)。

四膜虫(Tetrahymena)是一种营自由生活的单细胞真核生物，隶属于原生动物中的纤毛门寡毛纲膜口目，广泛分布于全球各地的淡水环境中。四膜虫作为第一种实现细胞同步化的真核生物可以进行无菌纯培养，而且生长快(2-2.5小时繁殖一代)；比较基因组的研究也显示嗜热四膜虫较酵母等模式生物和人类具有更高程度的功能保守性；加之四膜虫中已建立了成熟的基因操作技术，是毒理学与生态毒理学研究中的优良模式生物(Turkewitz AP，Orias E，Kapler G.Functional genomics：the coming of age for Tetrahymena thermophila.Trends Genet.2002，18(1)：35-40；Coollins K，Gorovsky MA.Tetrahymena thermophila.Curr Biol.2005，15(9)：R317-318；傅诚杰，俞婷，缪炜，沈韫芬。四膜虫：毒理学与生态毒理学研究中的优良模式生物。动物学杂志。2005，40(1)：108-113。)。