[发明专利]一种重组甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1的原核表达、纯化及其检测方法的建立

说明书

技术领域

本发明属于人畜共患病研究领域，涉及一种人畜共患病的鉴别诊断方法。选择了公开的甲型H1N1加利福尼亚病毒株(A/California/08/2009(H1N1))cDNA序列中非结构蛋白NS1基因为研究内容，利用通过基因合成方法获得基因片段构建原核表达载体pGEX-6P-1-NS1；将阳性重组质粒转化到大肠杆菌中得到重组菌株(Escherichia coli BL21 rosseta/pGEX-6P-1-NS1)；通过多种层析方法获得纯化后的H1N1的非结构蛋白NS1，并利用所述的表达蛋白通过免疫宿主动物获得特异性针对H1N1非结构蛋白NS1的多克隆或单克隆抗体，建立酶联免疫吸附试验鉴别诊断方法，用于区分甲型H1N1流感病毒感染与其他流感病毒感染的病人。

背景技术

H1N1是一种病毒，是Orthomyxoviridae系列的一种病毒。它的宿主是鸟类和一些哺乳动物。有些H1N1病毒引起严重的疾病大多发生于家禽方面，而人类却很少出现。但经过鸟类和哺乳动物的传播和变异，这可能导致疫情或人类流感大面积传播。

H1N1的A型流感病毒于1918-1919年造成西班牙流感流行，导致2000万-4000万人死亡。1977年，H1N1与H3N2亚型病毒共同在人类流行，如果抗原变异或与其他流感病毒亚型发生基因重排产生新的病毒株，则极可能引起大流行。

研究表明，NS1蛋白仅在流感病毒感染的细胞中大量表达，而在正常病毒粒子中不存在，同时经灭活疫苗免疫的动物也不会产生，因此，针对NS1蛋白的抗体可能只在流感病毒的宿主中存在，据此可以区分灭活疫苗免疫动物与活病毒感染动物。已有研究表明，非结构蛋白及其抗体可以作为病毒感染的一个重要标记。上述特点使NS1蛋白在流感病毒的监测和抗病毒研究中有着广阔的应用前景。

发明内容

本发明目的之一是提供一种重组甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1的原核表达与纯化的方法，为其抗体的制备提供高纯度抗原。

其中所述的重组蛋白的制备方法，它包括下列步骤：

(1)公开的甲型H1N1加利福尼亚病毒(A/California/08/2009(H1N1))cDNA序列中非结构蛋白NS1基因为目的基因，通过基因合成的方法获得基因片段；

(2)在原核表达载体pGEX-6P-1多克隆位点中定向插入甲型H1N1流感病毒非结构蛋白基因NS1的DNA序列，构建得到原核表达载体质粒pGEX-6P-1-NS1；

(3)将步骤(2)所说的原核表达载体质粒pGEX-6P-1-NS1转化至大肠杆菌BL21 rosseta感受态细胞，用氨苄霉素抗性筛选单个重组菌。

(4)所述纯化具体是：pGEX-6P-1-NS1在大肠杆菌Rosetta中表达，克隆接种至3ml含有100ug/ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37℃，过夜，220rpm；将过夜培养物1∶100稀释至1L含有100ug/ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37℃，220rpm，培养5h；加入终浓度为0.1mM的IPTG，22℃，180rpm，继续培养22h；以8000g，15min，4℃离心收菌；菌体用50mM Tris-c1，200mM NaCl pH8.0悬起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT，0.5h；用超声破碎仪超声至溶液澄清，12000rpm，20min离心3次；将上清液使用GE healthcare的Glutathione-Sepharose4B柱料纯化，得到纯化融合蛋白。PSP酶切GST标签，柱料纯化，得到除去标签的NS1蛋白。

实验证明，纯化后NS1可溶性极高，一年内未有聚合物出现。

本发明提供的利用Pgex-6P-1系统融合表达再经酶切处理去掉标签制得的NS1蛋白，可以在大肠杆菌中成功表达，表达量与前人的结果类似，相对于真核表达，原核表达制备工程化抗体技术相对简单，成本更低；

本发明目的之二是提供一种基于特异性检测甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1的免疫学方法的H1N1检测试剂盒。

将纯化后重组NS1蛋白作为抗原分别免疫家兔和小鼠，获得高特异性针对NS1蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体；

6)利用获得的抗体及高纯度的重组NS1蛋白，利用包括但不限于双夹心ELISA法、免疫比浊法等方法检测人体液中的NS1的含量；